發(fā)布時間：2017-09-15 05:14

  本文關鍵詞：水稻基腐病菌flhDC和fliA基因的功能

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【摘要】：【目的】水稻細菌性基腐病(致病菌Dickeya zeae)是水稻重要細菌病害之一。細菌的鞭毛是重要的運動器官,迄今有關水稻基腐病菌的鞭毛系統(tǒng)、flh DC和fli A基因功能及其調控機理尚不清楚,明確這些鞭毛基因的功能,有利于進一步了解D.zeae的致病性綜合調控網絡、開發(fā)新型藥物作用靶標以及制定病害防控策略。論文旨在明確D.zeae鞭毛系統(tǒng)中flh DC和fli A在致病性中的作用�！痉椒ā恳訢.zeae野生型致病菌株EC1基因組DNA為模板,設計一系列引物,PCR擴增待敲除的目標基因flh DC和fli A各自的上、下游片段,再以混合的上、下游片段為模板,擴增得到缺失flh DC和fli A的融合片段,雙酶切純化后連接到自殺性載體p KNG101上,構建帶有反向篩選標記基因sac B的自殺重組質粒p KNG-Δflh DC和p KNG-ΔfliA,通過三親轉化方法分別將重組質粒導入野生型菌株EC1中,通過兩次等位基因同源重組,PCR檢測和測序驗證,最終獲得目標基因flh DC和fli A缺失突變體Δflh DC和ΔfliA;測定并比較突變體與野生菌的胞外酶活性、毒素活性、運動性、生物膜形成能力,以及對水稻的致病力和對煙草的過敏性反應(HR);進一步提取細菌總RNA,以16Sr DNA為內參來校正目標基因的表達量,采用實時熒光定量PCR(q RT-PCR)方法,比較野生菌和突變體Δflh DC和ΔfliA下游基因flh D、flh C、fli A和fli C的表達量差異�！窘Y果】通過基因操作手段成功構建了基因缺失突變體Δflh DC和ΔfliA。表型測定結果顯示,野生菌EC1的運動性和形成生物膜的能力很強,而基因缺失菌株Δflh DC和ΔfliA的運動性和形成生物膜的能力明顯下降;野生菌株EC1對水稻種子萌發(fā)具有很強的抑制作用,而突變體Δflh DC和ΔfliA則顯著降低了對水稻種子萌發(fā)的抑制作用;接種野生菌株EC1的水稻植株產生大面積褐色病斑,且腐爛程度嚴重,而接種突變體Δflh DC和ΔfliA的水稻植株只在接種的針刺部位周圍出現水漬狀褐色病斑,腐爛程度輕微,說明突變體菌株Δflh DC和ΔfliA顯著降低了對水稻植株上的致病力。進一步的表型測定結果顯示,突變體菌株Δflh DC和ΔfliA與野生菌EC1在產生胞外致病酶、毒素以及引起煙草HR能力等方面沒有顯著差異。q RT-PCR分析結果顯示,在突變體菌株Δflh DC中,flh D和flh C不表達,fli A和fli C的表達量較野生菌明顯下降;而在突變體ΔfliA中,flh D、flh C和fli A均不表達,fli C表達明顯下降�！窘Y論】調控細菌鞭毛基因表達的主調控因子flh DC操縱子,以及表達鞭毛特異性因子σ~(28)基因fli A,是細菌鞭毛系統(tǒng)基因簇的重要組分。flhDC和fliA顯著影響D.zeae的運動性和生物膜形成能力,并顯著影響水稻種子的萌發(fā)功能,在水稻基腐病菌的致病性中起重要作用。
【作者單位】： 華南農業(yè)大學農學院/廣東省微生物信號與作物病害重點實驗室;
【關鍵詞】： 水稻基腐病菌 flhDC fliA 運動性 致病性
【基金】：國家自然科學基金(31371903)
【分類號】：S435.111.4
【正文快照】： 【研究意義】水稻細菌性基腐病是由玉米狄克氏菌(Dickeya zeae,異名Erwinia chrysanthemi pv.zeae)引起的水稻重要細菌病害之一[1]。D.zeae已成為世界性重要植物病原細菌,發(fā)生范圍不斷擴大[2-3]。該病原菌相關致病因子主要包括胞外酶、胞外多糖、毒素和hrp基因簇。細菌的鞭毛，

本文編號：854511