發(fā)布時間：2017-09-13 22:43

  本文關鍵詞：轉Bt-pta基因水稻后代分子檢測與抗蟲性鑒定

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【摘要】：水稻是世界上最重要糧食作物之一,世界上近半數人口以稻米為食。一直以來,蟲害是危害水稻產量的重要因素之一,而利用轉基因技術培育抗蟲水稻,可以有效解決這個問題。本研究以優(yōu)良水稻恢復系輻恢838為受體材料,采用農桿菌介導法,將重組表達載體pCAMBIA1301-Bt-pta轉入其中,通過報告基因GUS表達檢測,目的基因PCR檢測,篩選出陽性T_0代轉基因水稻;將其收獲后種植,對其進行報告基因GUS表達檢測,及目的基因PCR檢測,檢測出T_1代雙價轉基因水稻,對其進行抗蟲性鑒定;將抗蟲效果較好的雙價轉基因水稻收獲后種下,得到T_2代轉基因水稻,每個株系取10株,對目的基因進行PCR檢測,獲得純合的雙價抗蟲轉基因水稻。本論文獲得的具體結果如下:1.構建雙價植物表達載體:首先構建中間載體,用HindⅢ和SpeI分別對基礎表達載體pCAMBIA1301和質粒pUC57-Bt進行雙酶切,回收目的基因Bt和載體骨架pCAMBIA1301,然后通過T4 DNA連接酶將目的基因連接到載體骨架上,構建中間載體pCAMBIA1301-Bt;然后用HindⅢ分別酶切pCU57-pta與中間載體pCAMBIA1301-Bt,回收目的基因與中間載體骨架,再用T4 DNA連接酶將目的基因pta連接到中間載體骨架上,成功構建植物表達質粒pCAMBIA1301-Bt-pta。2.T_0代轉基因水稻的獲得及初步檢測:用農桿菌介導法將雙價植物表達載體pCAMBIA1301-Bt-pta轉化優(yōu)良水稻恢復系輻恢838,經馴化后移栽共獲得105株再生植株,經過GUS化學組織染色及PCR檢測,最終得到3個T_0代轉雙價基因陽性轉化子。3.T_1代轉基因水稻的分子檢測及抗蟲性鑒定:將分單株收獲的T_0代轉基因水稻種子種下,得到T_1代轉基因水稻株系,檢測其報告基因GUS表達水平,并對初步檢測出的陽性植株進行目的基因PCR檢測、Bt毒蛋白表達酶聯免疫檢測以及室內和室外的抗蟲性檢測,共檢測出29株抗蟲效果較好的雙價轉基因水稻,并對其農藝性狀進行考察。4.T_2代純合雙價轉基因水稻的獲得:分單株收獲T_1代29株抗蟲效果較好的雙價轉基因水稻,種植獲得29個株系,每個株系隨機取10株,PCR法檢測目的基因,10株全含目的基因的株系共29個,該29株系即為目的基因純合株系,為以后組配雜交組合,獲得抗蟲雜交水稻提供恢復系材料。
【關鍵詞】：水稻 Bt pta 抗蟲 轉基因
【學位授予單位】：貴州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S435.11
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 英文縮略詞與英漢對照10-11
• 第一章 前言11-22
• 1 文獻綜述11-19
• 1.1 雙價轉基因水稻的研究進展11-16
• 1.1.1 Pta基因及轉pta基因抗蟲水稻的作用機理12-13
• 1.1.2 Bt基因及轉Bt基因抗蟲水稻的作用機理13-14
• 1.1.3 轉基因抗蟲水稻的安全性14-15
• 1.1.4 轉基因水稻研究的展望15-16
• 1.2 轉基因植株的檢測16-19
• 2 本研究的目的、意義以及主要研究內容19-22
• 2.1 研究目的和意義19-20
• 2.2 研究的主要內容20-22
• 第二章 T_0代轉基因水稻植株的轉化及初步篩選22-32
• 1 材料22-23
• 1.1 供試水稻品種22
• 1.2 菌株和質粒22
• 1.3 主要試劑及引物22-23
• 1.3.1 主要試劑22-23
• 1.3.2 引物23
• 1.4 主要儀器23
• 1.5 主要溶液配方23
• 2 方法23-27
• 2.1 雙價載體pCAMBIA1301-Bt-pta的構建23-24
• 2.2 農桿菌介導的水稻遺傳轉化24
• 2.3 轉基因水稻再生植株煉苗及移栽24
• 2.4 轉Bt-pta水稻再生植株檢測24-27
• 2.4.1 GUS檢測24-25
• 2.4.2 轉Bt-pta水稻再生植株基因組DNA提取25
• 2.4.3 陽性對照質粒提取25-26
• 2.4.4 轉Bt-pta基因再生植株的PCR檢測26-27
• 2.4.5 DNA瓊脂糖凝膠電泳27
• 3 結果與分析27-30
• 3.1 重組表達載體pCAMBIA1301-Bt-pta的構建27-28
• 3.2 再生植株的獲得28
• 3.3 轉Bt-pta基因水稻再生植株鑒定28-30
• 3.3.1 GUS組織化學染色分析28-29
• 3.3.2 轉基因植株的PCR檢測29-30
• 4 討論30-32
• 4.1 關于雙價轉基因抗蟲水稻的獲得30-31
• 4.2 關于雙價轉基因抗蟲水稻的抗蟲性鑒定31-32
• 第三章 T_1代和T_2代轉基因水稻的分子檢測及抗蟲性鑒定32-47
• 1 材料32-33
• 1.1 水稻材料32
• 1.2 質粒32
• 1.3 主要試劑及引物32
• 1.3.1 主要試劑32
• 1.3.2 引物32
• 1.4 主要儀器32-33
• 1.5 主要試劑配方33
• 1.6 供試昆蟲33
• 2 方法33-38
• 2.1 T_1代轉基因水稻的分子檢測33-35
• 2.1.1 T_1代轉基因水稻的GUS檢測33
• 2.1.2 T_1代轉基因水稻的PCR檢測33-34
• 2.1.3 T_1代轉基因水稻中Bt毒蛋白的含量與其抗蟲性的關系34-35
• 2.2 T_1代轉基因水稻抗蟲性鑒定35-37
• 2.2.1 T_1代轉基因水稻抗蟲性室內鑒定35-36
• 2.2.2 T_1代轉基因水稻抗蟲性田間鑒定36-37
• 2.2.3 田間自然發(fā)蟲的調查37
• 2.3 T_1代轉基因水稻主要農藝性狀的考察37
• 2.4 T_2代轉基因水稻的分子檢測37-38
• 3 結果與分析38-45
• 3.1 T_1轉基因水稻的分子檢測38-39
• 3.1.1 轉基因水稻的GUS檢測38
• 3.1.2 T_1代轉基因水稻的PCR檢測38-39
• 3.2 T_1代轉基因水稻中Bt毒蛋白的含量與其抗蟲性的關系39-41
• 3.2.1 T_1代轉基因水稻Cry1C蛋白ELISA檢測標準曲線繪制39-40
• 3.2.2 T_1代轉基因水稻Cry1C蛋白ELISA檢測40-41
• 3.3 T_1代轉基因水稻的抗蟲性鑒定41-44
• 3.3.1 T_1代轉基因水稻的室內抗蟲性鑒定41-42
• 3.3.2 T_1代轉基因水稻的田間抗蟲性鑒定42-44
• 3.3.3 T_1代轉基因水稻的田間自然發(fā)蟲調查44
• 3.4 T_1代轉基因水稻的農藝性狀的考察44-45
• 3.5 T_2代轉基因水稻的分子檢測45
• 4 討論45-47
• 4.1 關于高抗性、穩(wěn)定遺傳的雙價轉基因水稻的獲得45-46
• 4.2 關于雙價轉基因水稻農藝性狀的改變46-47
• 第四章 結論與展望47-49
• 1 結論47
• 2 創(chuàng)新點47
• 3 展望47-49
• 致謝49-51
• 參考文獻51-56
• 附錄一56-57
• 附錄二57-58

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本文編號：846362