發(fā)布時(shí)間：2017-09-13 22:43

  本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)Bt-pta基因水稻后代分子檢測(cè)與抗蟲(chóng)性鑒定

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【摘要】：水稻是世界上最重要糧食作物之一,世界上近半數(shù)人口以稻米為食。一直以來(lái),蟲(chóng)害是危害水稻產(chǎn)量的重要因素之一,而利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗蟲(chóng)水稻,可以有效解決這個(gè)問(wèn)題。本研究以?xún)?yōu)良水稻恢復(fù)系輻恢838為受體材料,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,將重組表達(dá)載體pCAMBIA1301-Bt-pta轉(zhuǎn)入其中,通過(guò)報(bào)告基因GUS表達(dá)檢測(cè),目的基因PCR檢測(cè),篩選出陽(yáng)性T_0代轉(zhuǎn)基因水稻;將其收獲后種植,對(duì)其進(jìn)行報(bào)告基因GUS表達(dá)檢測(cè),及目的基因PCR檢測(cè),檢測(cè)出T_1代雙價(jià)轉(zhuǎn)基因水稻,對(duì)其進(jìn)行抗蟲(chóng)性鑒定;將抗蟲(chóng)效果較好的雙價(jià)轉(zhuǎn)基因水稻收獲后種下,得到T_2代轉(zhuǎn)基因水稻,每個(gè)株系取10株,對(duì)目的基因進(jìn)行PCR檢測(cè),獲得純合的雙價(jià)抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因水稻。本論文獲得的具體結(jié)果如下:1.構(gòu)建雙價(jià)植物表達(dá)載體:首先構(gòu)建中間載體,用HindⅢ和SpeI分別對(duì)基礎(chǔ)表達(dá)載體pCAMBIA1301和質(zhì)粒pUC57-Bt進(jìn)行雙酶切,回收目的基因Bt和載體骨架pCAMBIA1301,然后通過(guò)T4 DNA連接酶將目的基因連接到載體骨架上,構(gòu)建中間載體pCAMBIA1301-Bt;然后用HindⅢ分別酶切pCU57-pta與中間載體pCAMBIA1301-Bt,回收目的基因與中間載體骨架,再用T4 DNA連接酶將目的基因pta連接到中間載體骨架上,成功構(gòu)建植物表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA1301-Bt-pta。2.T_0代轉(zhuǎn)基因水稻的獲得及初步檢測(cè):用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將雙價(jià)植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-Bt-pta轉(zhuǎn)化優(yōu)良水稻恢復(fù)系輻恢838,經(jīng)馴化后移栽共獲得105株再生植株,經(jīng)過(guò)GUS化學(xué)組織染色及PCR檢測(cè),最終得到3個(gè)T_0代轉(zhuǎn)雙價(jià)基因陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。3.T_1代轉(zhuǎn)基因水稻的分子檢測(cè)及抗蟲(chóng)性鑒定:將分單株收獲的T_0代轉(zhuǎn)基因水稻種子種下,得到T_1代轉(zhuǎn)基因水稻株系,檢測(cè)其報(bào)告基因GUS表達(dá)水平,并對(duì)初步檢測(cè)出的陽(yáng)性植株進(jìn)行目的基因PCR檢測(cè)、Bt毒蛋白表達(dá)酶聯(lián)免疫檢測(cè)以及室內(nèi)和室外的抗蟲(chóng)性檢測(cè),共檢測(cè)出29株抗蟲(chóng)效果較好的雙價(jià)轉(zhuǎn)基因水稻,并對(duì)其農(nóng)藝性狀進(jìn)行考察。4.T_2代純合雙價(jià)轉(zhuǎn)基因水稻的獲得:分單株收獲T_1代29株抗蟲(chóng)效果較好的雙價(jià)轉(zhuǎn)基因水稻,種植獲得29個(gè)株系,每個(gè)株系隨機(jī)取10株,PCR法檢測(cè)目的基因,10株全含目的基因的株系共29個(gè),該29株系即為目的基因純合株系,為以后組配雜交組合,獲得抗蟲(chóng)雜交水稻提供恢復(fù)系材料。
【關(guān)鍵詞】：水稻 Bt pta 抗蟲(chóng) 轉(zhuǎn)基因
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S435.11
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 英文縮略詞與英漢對(duì)照10-11
• 第一章 前言11-22
• 1 文獻(xiàn)綜述11-19
• 1.1 雙價(jià)轉(zhuǎn)基因水稻的研究進(jìn)展11-16
• 1.1.1 Pta基因及轉(zhuǎn)pta基因抗蟲(chóng)水稻的作用機(jī)理12-13
• 1.1.2 Bt基因及轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)水稻的作用機(jī)理13-14
• 1.1.3 轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻的安全性14-15
• 1.1.4 轉(zhuǎn)基因水稻研究的展望15-16
• 1.2 轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)16-19
• 2 本研究的目的、意義以及主要研究?jī)?nèi)容19-22
• 2.1 研究目的和意義19-20
• 2.2 研究的主要內(nèi)容20-22
• 第二章 T_0代轉(zhuǎn)基因水稻植株的轉(zhuǎn)化及初步篩選22-32
• 1 材料22-23
• 1.1 供試水稻品種22
• 1.2 菌株和質(zhì)粒22
• 1.3 主要試劑及引物22-23
• 1.3.1 主要試劑22-23
• 1.3.2 引物23
• 1.4 主要儀器23
• 1.5 主要溶液配方23
• 2 方法23-27
• 2.1 雙價(jià)載體pCAMBIA1301-Bt-pta的構(gòu)建23-24
• 2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化24
• 2.3 轉(zhuǎn)基因水稻再生植株煉苗及移栽24
• 2.4 轉(zhuǎn)Bt-pta水稻再生植株檢測(cè)24-27
• 2.4.1 GUS檢測(cè)24-25
• 2.4.2 轉(zhuǎn)Bt-pta水稻再生植株基因組DNA提取25
• 2.4.3 陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒提取25-26
• 2.4.4 轉(zhuǎn)Bt-pta基因再生植株的PCR檢測(cè)26-27
• 2.4.5 DNA瓊脂糖凝膠電泳27
• 3 結(jié)果與分析27-30
• 3.1 重組表達(dá)載體pCAMBIA1301-Bt-pta的構(gòu)建27-28
• 3.2 再生植株的獲得28
• 3.3 轉(zhuǎn)Bt-pta基因水稻再生植株鑒定28-30
• 3.3.1 GUS組織化學(xué)染色分析28-29
• 3.3.2 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)29-30
• 4 討論30-32
• 4.1 關(guān)于雙價(jià)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻的獲得30-31
• 4.2 關(guān)于雙價(jià)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻的抗蟲(chóng)性鑒定31-32
• 第三章 T_1代和T_2代轉(zhuǎn)基因水稻的分子檢測(cè)及抗蟲(chóng)性鑒定32-47
• 1 材料32-33
• 1.1 水稻材料32
• 1.2 質(zhì)粒32
• 1.3 主要試劑及引物32
• 1.3.1 主要試劑32
• 1.3.2 引物32
• 1.4 主要儀器32-33
• 1.5 主要試劑配方33
• 1.6 供試?yán)ハx(chóng)33
• 2 方法33-38
• 2.1 T_1代轉(zhuǎn)基因水稻的分子檢測(cè)33-35
• 2.1.1 T_1代轉(zhuǎn)基因水稻的GUS檢測(cè)33
• 2.1.2 T_1代轉(zhuǎn)基因水稻的PCR檢測(cè)33-34
• 2.1.3 T_1代轉(zhuǎn)基因水稻中Bt毒蛋白的含量與其抗蟲(chóng)性的關(guān)系34-35
• 2.2 T_1代轉(zhuǎn)基因水稻抗蟲(chóng)性鑒定35-37
• 2.2.1 T_1代轉(zhuǎn)基因水稻抗蟲(chóng)性室內(nèi)鑒定35-36
• 2.2.2 T_1代轉(zhuǎn)基因水稻抗蟲(chóng)性田間鑒定36-37
• 2.2.3 田間自然發(fā)蟲(chóng)的調(diào)查37
• 2.3 T_1代轉(zhuǎn)基因水稻主要農(nóng)藝性狀的考察37
• 2.4 T_2代轉(zhuǎn)基因水稻的分子檢測(cè)37-38
• 3 結(jié)果與分析38-45
• 3.1 T_1轉(zhuǎn)基因水稻的分子檢測(cè)38-39
• 3.1.1 轉(zhuǎn)基因水稻的GUS檢測(cè)38
• 3.1.2 T_1代轉(zhuǎn)基因水稻的PCR檢測(cè)38-39
• 3.2 T_1代轉(zhuǎn)基因水稻中Bt毒蛋白的含量與其抗蟲(chóng)性的關(guān)系39-41
• 3.2.1 T_1代轉(zhuǎn)基因水稻Cry1C蛋白ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制39-40
• 3.2.2 T_1代轉(zhuǎn)基因水稻Cry1C蛋白ELISA檢測(cè)40-41
• 3.3 T_1代轉(zhuǎn)基因水稻的抗蟲(chóng)性鑒定41-44
• 3.3.1 T_1代轉(zhuǎn)基因水稻的室內(nèi)抗蟲(chóng)性鑒定41-42
• 3.3.2 T_1代轉(zhuǎn)基因水稻的田間抗蟲(chóng)性鑒定42-44
• 3.3.3 T_1代轉(zhuǎn)基因水稻的田間自然發(fā)蟲(chóng)調(diào)查44
• 3.4 T_1代轉(zhuǎn)基因水稻的農(nóng)藝性狀的考察44-45
• 3.5 T_2代轉(zhuǎn)基因水稻的分子檢測(cè)45
• 4 討論45-47
• 4.1 關(guān)于高抗性、穩(wěn)定遺傳的雙價(jià)轉(zhuǎn)基因水稻的獲得45-46
• 4.2 關(guān)于雙價(jià)轉(zhuǎn)基因水稻農(nóng)藝性狀的改變46-47
• 第四章 結(jié)論與展望47-49
• 1 結(jié)論47
• 2 創(chuàng)新點(diǎn)47
• 3 展望47-49
• 致謝49-51
• 參考文獻(xiàn)51-56
• 附錄一56-57
• 附錄二57-58

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本文編號(hào)：846362