本文關(guān)鍵詞：Lux發(fā)光基因標(biāo)記大腸桿菌模型的構(gòu)建及其生物膜的研究

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【摘要】：Lux發(fā)光基因可編碼合成熒光素酶,進(jìn)而催化底物進(jìn)行發(fā)光反應(yīng),產(chǎn)生波長(zhǎng)約為450-490nm的可見(jiàn)藍(lán)綠光,其作為報(bào)告基因被迅速地應(yīng)用于在線觀測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全控制、活體動(dòng)物檢測(cè)等多種研究領(lǐng)域。細(xì)菌生物膜是細(xì)菌對(duì)惡劣環(huán)境產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)而形成的一種自我保護(hù)狀態(tài),細(xì)菌形成生物膜后難以被除殺滅,給食品加工、醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域帶來(lái)危害和難題。本研究將質(zhì)粒pHSG396-P.luxCDABE(攜帶發(fā)光光桿狀菌lux基因片段)導(dǎo)入大腸桿菌DH5α,以檢測(cè)發(fā)光情況和酶切電泳驗(yàn)證等手段,篩選出成功表達(dá)發(fā)光的重組大腸桿菌,成功構(gòu)建形成生物膜能力良好的重組發(fā)光大腸桿菌模型。對(duì)重組發(fā)光大腸桿菌的生理特性及生物膜與發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系進(jìn)行了深入研究,試驗(yàn)得出以下結(jié)論:1.重組發(fā)光大腸桿菌的生理特性:(1)以新鮮LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)重組發(fā)光大腸桿菌,測(cè)定其生長(zhǎng)曲線和發(fā)光曲線。結(jié)果顯示,重組發(fā)光大腸桿菌在培養(yǎng)的0-3 h為調(diào)整期,4-8 h為對(duì)數(shù)期,第9 h進(jìn)入穩(wěn)定期;在調(diào)整期和對(duì)數(shù)期初期發(fā)光微弱,進(jìn)入對(duì)數(shù)期后,發(fā)光強(qiáng)度快速增長(zhǎng),在第9 h達(dá)到培養(yǎng)階段的最大發(fā)光值2510 RLU,進(jìn)入穩(wěn)定期后,發(fā)光強(qiáng)度逐漸減弱。(2)不同的培養(yǎng)環(huán)境(IPTG濃度、pH、Cml濃度、癸醛濃度、溫度)下,測(cè)定重組發(fā)光大腸桿菌的生長(zhǎng)OD600nm值和發(fā)光強(qiáng)度。結(jié)果顯示,IPTG加入量小于0.2 mg/mL時(shí),對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的促進(jìn)作用微弱,超過(guò)這個(gè)量則對(duì)發(fā)光強(qiáng)度起到了抑制作用;其在pH 5-9范圍內(nèi)能夠發(fā)光,pH 7時(shí)生長(zhǎng)和發(fā)光強(qiáng)度最大,pH 8弱堿性環(huán)境中發(fā)光強(qiáng)度高于pH 6弱酸性環(huán)境(生長(zhǎng)濃度相同);Cml添加量為0-37.5μg/mL時(shí),對(duì)其生長(zhǎng)和發(fā)光強(qiáng)度影響微弱,超過(guò)此范圍,則對(duì)生長(zhǎng)有一定抑制作用;癸醛的添加對(duì)發(fā)光強(qiáng)度無(wú)促進(jìn)作用;在37℃下,其生長(zhǎng)和發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最大值,最高耐受溫度為43℃;室溫下,前15 min發(fā)光強(qiáng)度呈下降趨勢(shì),之后趨于平緩,在2 h內(nèi),發(fā)光強(qiáng)度始終處于400 RLU以上。2.重組發(fā)光大腸桿菌生物膜與發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系:(1)在四種因素(pH、D-甘露糖、菌懸液濃度、Cml濃度)條件下培養(yǎng)重組發(fā)光大腸桿菌生物膜,以結(jié)晶紫染色法和測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度法對(duì)生物膜的生成量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示,pH 8的弱堿性條件比pH 7的中性條件更利于生物膜的生長(zhǎng);D-甘露糖為培養(yǎng)重組發(fā)光大腸桿菌生物膜所必需,添加量為2.0%時(shí),生物膜形成量最大;菌懸液OD600nm值為0.3時(shí),為最佳配比,最利于生物膜的形成,過(guò)高或過(guò)低均不利于生物膜的生長(zhǎng);Cml濃度為12.5μg/mL時(shí),為本次試驗(yàn)培養(yǎng)重組發(fā)光大腸桿菌生物膜的最適濃度。(2)將發(fā)光強(qiáng)度法得到的數(shù)據(jù)與結(jié)晶紫染色法數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。結(jié)果顯示,兩種方法得到的數(shù)據(jù)線性相關(guān)性良好(R-Sq90%),說(shuō)明在適宜的培養(yǎng)條件下,發(fā)光強(qiáng)度法同樣可以衡量細(xì)菌生物膜的生成量。
【關(guān)鍵詞】：lux基因 大腸桿菌 生物膜 D-甘露糖
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q78
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-23
• 1.1 生物發(fā)光12-13
• 1.1.1 發(fā)光細(xì)菌12
• 1.1.2 發(fā)光細(xì)菌發(fā)光機(jī)理12-13
• 1.1.3 發(fā)光細(xì)菌的lux系統(tǒng)13
• 1.2 細(xì)菌生物膜13-16
• 1.2.1 細(xì)菌生物膜的特點(diǎn)14
• 1.2.2 生物膜的形成14-16
• 1.3 Lux發(fā)光基因和細(xì)菌生物膜的研究現(xiàn)狀16-21
• 1.3.1 lux發(fā)光系統(tǒng)的發(fā)展16
• 1.3.2 lux基因的應(yīng)用特性研究16-18
• 1.3.3 lux基因作為標(biāo)記基因和報(bào)告基因的應(yīng)用18-19
• 1.3.4 lux基因與其他報(bào)告基因的比較19
• 1.3.5 lux系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)19-20
• 1.3.6 細(xì)菌生物膜的體外研究現(xiàn)狀20-21
• 1.4 目的意義和研究?jī)?nèi)容21-23
• 1.4.1 研究目的意義21
• 1.4.2 研究?jī)?nèi)容21-22
• 1.4.3 技術(shù)路線22-23
• 第二章 產(chǎn)生物膜大腸桿菌的篩選和重組發(fā)光大腸桿菌模型的構(gòu)建及驗(yàn)證23-29
• 2.1 引言23
• 2.2 材料與方法23-27
• 2.2.1 供試菌株與質(zhì)粒23-24
• 2.2.2 酶、試劑、材料和培養(yǎng)基24
• 2.2.3 主要試驗(yàn)儀器與設(shè)備24-25
• 2.2.4 試驗(yàn)方法25-27
• 2.3 結(jié)果分析27-28
• 2.3.1 產(chǎn)生物膜大腸桿菌的選擇27
• 2.3.2 重組發(fā)光大腸桿菌的驗(yàn)證27-28
• 2.4 小結(jié)28-29
• 第三章 Lux發(fā)光基因大腸桿菌模型生理特性研究29-37
• 3.1 引言29
• 3.2 材料與方法29-31
• 3.2.1 試驗(yàn)菌株與試劑29
• 3.2.2 主要試驗(yàn)儀器與設(shè)備29-30
• 3.2.3 試驗(yàn)方法30-31
• 3.3 結(jié)果分析31-35
• 3.3.1 重組發(fā)光大腸桿菌生長(zhǎng)曲線與發(fā)光曲線的測(cè)定31-32
• 3.3.2 IPTG對(duì)重組發(fā)光大腸桿菌生長(zhǎng)和發(fā)光強(qiáng)度的影響32
• 3.3.3 pH對(duì)重組發(fā)光大腸桿菌生長(zhǎng)和發(fā)光強(qiáng)度的影響32-33
• 3.3.4 Cml濃度對(duì)重組發(fā)光大腸桿菌生長(zhǎng)和發(fā)光強(qiáng)度的影響33
• 3.3.5 癸醛濃度對(duì)重組發(fā)光大腸桿菌發(fā)光強(qiáng)度的影響33-34
• 3.3.6 溫度對(duì)重組發(fā)光大腸桿菌生長(zhǎng)和發(fā)光強(qiáng)度的影響34-35
• 3.3.7 重組發(fā)光大腸桿菌發(fā)光穩(wěn)定性測(cè)定35
• 3.4 小結(jié)35-37
• 第四章 Lux發(fā)光基因大腸桿菌模型生物膜產(chǎn)生量和發(fā)光強(qiáng)度關(guān)系研究37-46
• 4.1 引言37
• 4.2 材料與試劑37-38
• 4.2.1 試驗(yàn)材料37-38
• 4.2.2 主要儀器與設(shè)備38
• 4.3 試驗(yàn)方法38-40
• 4.3.1 大腸桿菌生物膜的培養(yǎng)38-39
• 4.3.2 測(cè)定生物膜發(fā)光強(qiáng)度39
• 4.3.3 結(jié)晶紫染色法測(cè)定生物膜39
• 4.3.4 不同培養(yǎng)條件對(duì)大腸桿菌生物膜的影響39-40
• 4.4 結(jié)果與分析40-44
• 4.4.1 pH對(duì)大腸桿菌生物膜的影響40-41
• 4.4.2 D-甘露糖添加量對(duì)大腸桿菌生物膜的影響41-42
• 4.4.3 菌懸液濃度對(duì)大腸桿菌生物膜的影響42-43
• 4.4.4 Cml濃度對(duì)大腸桿菌生物膜的影響43-44
• 4.4.5 結(jié)晶紫染色法和發(fā)光強(qiáng)度法回歸分析44
• 4.5 小結(jié)44-46
• 第五章 結(jié)論與展望46-47
• 5.1 結(jié)論46
• 5.2 論文創(chuàng)新點(diǎn)46
• 5.3 展望46-47
• 參考文獻(xiàn)47-51
• 附錄51-52
• 致謝52-53
• 作者簡(jiǎn)介53

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