本文關(guān)鍵詞：鐵皮石斛糖基轉(zhuǎn)移酶基因分析及β-1,3葡聚糖合成酶基因的克隆

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【摘要】：鐵皮石斛,屬于蘭科石斛屬。為我國傳統(tǒng)名貴中藥材,具有很高的藥用價值。它的莖有鎮(zhèn)痛,消腫等作用,有效的增強機體的免疫活性。隨著鐵皮石斛生物學研究的深化,對于研究者來說控制重要的農(nóng)藝性狀的功能基因是有研究價值的。而其主要的藥用活性物質(zhì)是多糖,由于多糖結(jié)構(gòu)、組分復雜,其代謝途徑成為研究難點。于是研究人員從多糖合成相關(guān)的酶入手,探究多糖代謝途徑。本研究通過全基因組分析,研究鐵皮石斛多糖合成相關(guān)的基因。將鐵皮石斛基因組序列應用Genescan對潛在基因進行挖掘;在KEGG上下載擬南芥、番茄的糖代謝途徑的酶基因;分別用擬南芥和番茄的酶基因與鐵皮石斛基因組進行LocalBlast,對兩部分結(jié)果在進行比較、聚類分析,并預測多糖合成途徑。結(jié)合RACE技術(shù),進行鐵皮石斛β-1,3葡聚糖合成酶部分序列克隆。首先,將擬南芥的β-1,3葡聚糖合成酶基因與鐵皮石斛基因組進行本地Blast,得到5條與已知植物的β-1,3葡聚糖合成酶基因相似的scaffold;將5條scaffold在NCBI中進行ORF注釋;從中選取3條片段進行保守區(qū)域擴增;其中兩條進行3’端擴增,而后其中一條進行5’端擴增,克隆得到β-1,3葡聚糖合成酶部分序列。通過最后系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示,鐵皮石斛β-1,3葡聚糖合成酶基因與水稻相似度最高,達到近80%。通過本研究推測鐵皮石斛多糖合成途徑,是由核酸糖代謝提供單糖供體,蔗糖等寡糖作為主干鏈,在糖基轉(zhuǎn)移酶基因作用下單糖添加到寡糖鏈,構(gòu)成糖單元,糖單元再聚合為多糖;克隆得到鐵皮石斛β-1,3葡聚糖合成酶基因部分序列,為后續(xù)研究該基因功能、表達分析、以及研究多糖代謝途徑奠定研究基礎。
【關(guān)鍵詞】：鐵皮石斛 基因克隆 β-1 3葡聚糖合成酶
【學位授予單位】：云南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S567.239
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-10
• 縮為略詞表10-11
• 1.引言11-20
• 1.1 鐵皮石斛概述11-14
• 1.1.1 鐵皮石斛概述11
• 1.1.2 鐵皮石斛多糖藥理作用11-12
• 1.1.3 鐵皮石斛含糖量12-13
• 1.1.4 鐵皮石斛多糖組分及結(jié)構(gòu)分析13-14
• 1.2 糖基轉(zhuǎn)移酶概述14-17
• 1.2.1 糖基轉(zhuǎn)移酶概念及分類14-15
• 1.2.2 UGT基因家族研究進展15-16
• 1.2.3 β-1,3 葡聚糖合成酶基因16-17
• 1.3 全基因組研究技術(shù)17
• 1.4 基因克隆技術(shù)17-19
• 1.5 本研究的實際意義19-20
• 2.材料、試劑及儀器20-21
• 2.1 材料20
• 2.2 試劑20
• 2.3 儀器20-21
• 3.方法21-31
• 3.1 鐵皮石斛全基因組糖基轉(zhuǎn)移酶分析21-22
• 3.1.1 鐵皮石斛全基因組序列下載21
• 3.1.2 基因預測21
• 3.1.3 擬南芥和番茄糖代謝途徑相關(guān)基因序列下載21-22
• 3.1.4 數(shù)據(jù)處理22
• 3.2 鐵皮石斛基因組數(shù)據(jù)整合22
• 3.3 β-1,3 葡聚糖合成酶基因序列的探尋22
• 3.4 β-1,3 葡聚糖合成酶基因保守序列擴增驗證22-27
• 3.4.1 RNA提取22-23
• 3.4.2 反轉(zhuǎn)錄23
• 3.4.3 引物設計23-24
• 3.4.4 PCR擴增體系24
• 3.4.5 PCR擴增程序24-25
• 3.4.6 PCR產(chǎn)物切膠回收25
• 3.4.7 連接25-26
• 3.4.8 轉(zhuǎn)化26
• 3.4.9 質(zhì)粒提取26-27
• 3.4.10 酶切驗證27
• 3.5 β-1,3 葡聚糖合成酶基因 3'RACE27-29
• 3.5.1 RNA提取27
• 3.5.2 反轉(zhuǎn)錄27
• 3.5.3 引物設計27-28
• 3.5.4 PCR體系和程序28-29
• 3.5.5 切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取及酶切驗證29
• 3.6 β-1,3 葡聚糖合成酶基因 5’RACE29-31
• 3.6.1 RNA提取29
• 3.6.2 反轉(zhuǎn)錄29
• 3.6.3 β-1,3 葡聚糖合成酶基因 5’RACE PCR擴增29-30
• 3.6.4 切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取及酶切驗證30-31
• 4 結(jié)果31-48
• 4.1 鐵皮石斛全基因組糖基轉(zhuǎn)移酶基因分析31-37
• 4.1.1 擬南芥、番茄、水稻基因與鐵皮石斛基因LocalBlast結(jié)果31
• 4.1.2 糖基轉(zhuǎn)移酶基因系統(tǒng)進化關(guān)系31-35
• 4.1.3 鐵皮石斛多糖合成途徑預測35-37
• 4.2 β-1,3 葡聚糖基因的保守序列探尋37-38
• 4.2.1 鐵皮石斛基因組序列本地Blast37
• 4.2.2 NCBI注釋比對得到的scaffold37-38
• 4.3 β-1,3 葡聚糖基因保守區(qū)域擴增38-42
• 4.3.1 RNA提取38-39
• 4.3.2 葉片與莖的擴增39
• 4.3.3 β-1,3 葡聚糖基因保守序列擴增39-40
• 4.3.4 β-1,3 葡聚糖基因保守序列轉(zhuǎn)化40
• 4.3.5 β-1,3 葡聚糖基因保守序列菌落PCR驗證40-41
• 4.3.6 β-1,3 葡聚糖基因保守序列質(zhì)粒提取41
• 4.3.7 β-1,3 葡聚糖基因保守序列酶切41-42
• 4.3.8 β-1,3 葡聚糖基因保守序列測序42
• 4.4 β-1,3 葡聚糖合成酶基因 3’RACE42-46
• 4.4.1 β-1,3 葡聚糖合成酶基因 3’RACE PCR42-43
• 4.4.2 β-1,3 葡聚糖合成酶基因 3’RACE轉(zhuǎn)化43
• 4.4.3 β-1,3 葡聚糖合成酶基因 3’RAC菌落PCR驗證43-44
• 4.4.4 β-1,3 葡聚糖合成酶基因 3’RACE質(zhì)粒提取44
• 4.4.5 β-1,3 葡聚糖合成酶基因 3’RACE酶切44-45
• 4.4.6 β-1,3 葡聚糖合成酶基因 3’RACE測序45-46
• 4.5 β-1,3 葡聚糖基因的5’RACE46-48
• 5.討論48-51
• 5.1 鐵皮石斛多糖合成途徑48-49
• 5.2 β-1,3 葡聚糖基因基因克隆49-51
• 5.2.1 RNA提取49
• 5.2.2 RACE技術(shù)49-50
• 5.2.3 藍白斑篩選50-51
• 6.結(jié)論51-52
• 參考文獻52-60
• 附錄 1：試劑及溶液配制60-61
• 附錄 2：序列峰圖61-63
• 附錄 3：擬南芥、番茄糖分別與鐵皮石斛基因組LocalBlast結(jié)果63-73
• 致謝73-74
• 作者簡介74

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 梁忠紀;;鐵皮石斛的人工栽培[J];農(nóng)家之友;2003年03期

2 袁正仿,張?zhí)K鋒,遠凌威;鐵皮石斛高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培技術(shù)[J];河南農(nóng)業(yè)科學;2004年02期

3 查學強;魏鵬;羅建平;;8種產(chǎn)地鐵皮石斛蛋白質(zhì)和同工酶分析[J];安徽農(nóng)業(yè)科學;2007年27期

4 杜剛;楊海英;朱紹林;張廣求;;鐵皮石斛種子誘導成苗試驗[J];中藥材;2007年10期

5 張奇;段承俐;;鐵皮石斛的鑒定研究[J];生物技術(shù)通報;2008年06期

6 白美發(fā);黃敏;;鐵皮石斛高效設施栽培技術(shù)研究[J];安徽農(nóng)業(yè)科學;2008年35期

7 梁重堅;陳志權(quán);;鐵皮石斛組培小苗馴化和病蟲害防治技術(shù)[J];農(nóng)家之友(理論版);2009年03期

8 諸燕;斯金平;郭寶林;何伯偉;張愛蓮;;人工栽培鐵皮石斛多糖含量變異規(guī)律[J];中國中藥雜志;2010年04期

9 盧聲仙;何鐵光;王愛勤;黃島平;韋柱楊;張向軍;;廣西鐵皮石斛化學成分提取方法研究[J];西南農(nóng)業(yè)學報;2010年02期

10 高劍平;張梁;孫莉娜;邱小明;;鐵皮石斛組培快繁關(guān)鍵技術(shù)研究概述[J];福建農(nóng)業(yè)科技;2010年04期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 諸燕;斯金平;張愛蓮;;人工栽培鐵皮石斛多糖質(zhì)量分數(shù)研究[A];第八屆全國藥用植物及植物藥學術(shù)研討會論文集[C];2009年

2 陳立鉆;倪云霞;孫繼軍;范華芬;許安玲;;鐵皮石斛傳統(tǒng)加工品與機械加工品的多糖含量對比研究[A];全國第六屆天然藥物資源學術(shù)研討會論文集[C];2004年

3 郭英英;劉京晶;斯金平;;雁蕩山不同樹種活樹附生鐵皮石斛多糖含量差異比較[A];生態(tài)文明建設中的植物學：現(xiàn)在與未來——中國植物學會第十五屆會員代表大會暨八十周年學術(shù)年會論文集——第4分會場：資源植物學[C];2013年

4 王伯初;李標;;響應聲波加載的鐵皮石斛差異表達基因篩選及其功能初步研究[A];2008年全國生物流變學與生物力學學術(shù)會議論文摘要集[C];2008年

5 丁小余;侯北偉;謝明璐;;珍稀鐵皮石斛基于微衛(wèi)星標記的種質(zhì)鑒別與保護遺傳學研究[A];第九屆全國藥用植物及植物藥學術(shù)研討會論文集[C];2010年

6 朱波;斯金平;苑鶴;;鐵皮石斛雜交育種的初步研究[A];第九屆全國藥用植物及植物藥學術(shù)研討會論文集[C];2010年

7 李宏博;張宏宇;樸鐘云;;鐵皮石斛組織培養(yǎng)研究[A];第九屆全國藥用植物及植物藥學術(shù)研討會論文集[C];2010年

8 斯金平;;鐵皮石斛可持續(xù)發(fā)展關(guān)鍵技術(shù)研究進展[A];第十屆全國藥用植物及植物藥學術(shù)研討會論文摘要集[C];2011年

9 金璐英;斯金平;張愛蓮;魏濤;莫伊娜;;鐵皮石斛中基本氨基酸含量變異規(guī)律[A];第十屆全國藥用植物及植物藥學術(shù)研討會論文摘要集[C];2011年

10 張治國;劉驊;夏志俊;王君暉;黃純農(nóng);;鐵皮石斛種子的超低溫保存[A];中國植物生理學會全國學術(shù)年會暨成立40周年慶祝大會學術(shù)論文摘要匯編[C];2003年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 本報記者 王晶晶;鐵皮石斛扎根浙江[N];中國經(jīng)濟導報;2006年

2 施仁潮;鐵皮石斛研究成果驗收[N];科技日報;2006年

3 張文聰;做大鐵皮石斛種植業(yè) 幫助群眾走上致富路[N];韶關(guān)日報;2007年

4 本報記者 何潭振 戴正聰;讓所有老百姓都能吃得起鐵皮石斛[N];中國食品質(zhì)量報;2006年

5 本報記者　 王蔚佳;鐵皮石斛神話如何延續(xù)[N];中國醫(yī)藥報;2006年

6 施文;浙江將出臺鐵皮石斛品種標準[N];中國中醫(yī)藥報;2006年

7 本報記者 施仁潮;他讓瀕危中藥鐵皮石斛重獲新生[N];中國中醫(yī)藥報;2008年

8 中華中醫(yī)藥學會 莊乾竹;寶寶能喝鐵皮石斛水嗎？[N];健康時報;2008年

9 王英;“工廠”里種出鐵皮石斛[N];蘇州日報;2008年

10 收集整理 軍野;鐵皮石斛的文化淵源[N];世界報;2008年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 孫婧;鐵皮石斛提取物及其活性成分毛蘭素對人乳腺癌細胞抑制作用的研究[D];吉林大學;2016年

2 梁楚燕;基于衰老雌鼠模型探討鐵皮石斛“補腎”功效的科學內(nèi)涵[D];廣州中醫(yī)藥大學;2016年

3 徐程;鐵皮石斛種質(zhì)資源與組培工廠化生產(chǎn)研究[D];浙江大學;2006年

4 包英華;鐵皮石斛種質(zhì)資源的鑒定與評價研究[D];廣州中醫(yī)藥大學;2014年

5 嚴亮;中國傳統(tǒng)蘭科藥用植物鐵皮石斛基因組及其生物學特性研究[D];吉林大學;2014年

6 張澤錦;鐵皮石斛的光合碳同化途徑及其對環(huán)境變化的生理響應[D];中國農(nóng)業(yè)大學;2014年

7 趙興兵;超微鐵皮石斛對脾虛便秘小鼠腸道微生物的影響研究[D];湖南中醫(yī)藥大學;2014年

8 李標;聲波刺激對鐵皮石斛生長代謝的影響及其相關(guān)基因表達和克隆研究[D];重慶大學;2007年

9 滕建北;鐵皮石斛與美花石斛莖尖生長機理及其多糖累積規(guī)律研究[D];成都中醫(yī)藥大學;2009年

10 關(guān)杰敏;鐵皮石斛良種繁育與GAP種植關(guān)鍵技術(shù)研究[D];廣州中醫(yī)藥大學;2014年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 諸燕;鐵皮石斛種質(zhì)資源收集與評價[D];浙江農(nóng)林大學;2010年

2 辛甜;組培鐵皮石斛的品質(zhì)評價研究[D];遼寧中醫(yī)藥大學;2011年

3 戴燕萍;鐵皮石斛生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范研究[D];浙江農(nóng)林大學;2012年

4 王俊潔;鐵皮石斛體細胞無性變異的生藥學初步研究[D];云南中醫(yī)學院;2012年

5 李東賓;冷脅迫下鐵皮石斛抗寒基因的克隆與表達研究[D];浙江農(nóng)林大學;2013年

6 馮云;鐵皮石斛儲藏與加工特性研究[D];華南理工大學;2015年

7 鄧星燕;鐵皮石斛紫外指紋圖譜研究[D];云南民族大學;2015年

8 朱夢麗;鐵皮石斛甘露糖結(jié)合凝集素的分子建模與對接研究，及NAC基因組序列的克隆[D];西南交通大學;2015年

9 陳爾;鐵皮石斛組培快繁技術(shù)的優(yōu)化[D];中南林業(yè)科技大學;2015年

10 任潔;鐵皮石斛組培苗培養(yǎng)及叢生芽增殖體系的建立[D];南京師范大學;2015年

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本文編號：840829