本文關(guān)鍵詞：流產(chǎn)布魯菌pyk和ppdk基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性分析

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【摘要】：布魯菌是一種人畜共患病原菌,兼性胞內(nèi)寄生,革蘭氏染色呈陰性,感染后主要導(dǎo)致人的波狀熱和動(dòng)物的流產(chǎn)。布魯菌缺少典型的毒力因子,如細(xì)胞溶素、外毒素、莢膜等,其致病性主要表現(xiàn)為入侵靶細(xì)胞并在胞內(nèi)長(zhǎng)期存活的能力。近年來(lái),胞內(nèi)菌的碳代謝與細(xì)菌毒力之間的關(guān)系成為研究的熱點(diǎn),李斯特桿菌、志賀氏菌、結(jié)核桿菌等胞內(nèi)菌能夠通過(guò)調(diào)控自身代謝來(lái)適應(yīng)胞內(nèi)惡劣的生存環(huán)境,如低pH,營(yíng)養(yǎng)匱乏、氧化應(yīng)激等,而目前對(duì)布魯菌碳代謝與毒力的關(guān)系知之甚少。本實(shí)驗(yàn)室前期利用信號(hào)標(biāo)簽隨機(jī)突變(STM)技術(shù)篩選到了兩個(gè)與布魯菌毒力相關(guān)的碳代謝基因,即丙酮酸激酶基因(pyk,locus tag BAB_RS24320)和丙酮酸磷酸雙激酶基因(ppdk,locus tag BAB_RS18420)。為了進(jìn)一步研究pyk和ppdk基因功能,本研究利用同源重組方法構(gòu)建了pyk和ppdk定向缺失株,通過(guò)比較基因缺失后布魯菌的生物學(xué)特性變化來(lái)研究基因的功能,其中對(duì)pyk缺失株的研究更加深入。當(dāng)pyk基因缺失后,生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示布魯菌生長(zhǎng)速度減慢,尤其在營(yíng)養(yǎng)條件匱乏的條件下,減慢的趨勢(shì)更加顯著;耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Δpyk缺失株對(duì)氧化劑的耐受能力降低,然而對(duì)低pH、大牛血清、多粘菌素B的耐受能力與野毒相當(dāng);胞內(nèi)存活實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Δpyk在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活能力降低,并利用免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示了Δpyk在巨噬細(xì)胞內(nèi)減弱排斥溶酶體降解的能力;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Δpyk缺失株不能在小鼠體內(nèi)建立慢性感染,這與Δpyk缺失株胞內(nèi)存活能力減弱是密切相關(guān)的,表明pyk基因確實(shí)與布魯菌的毒力密切相關(guān)。當(dāng)ppdk缺失后,生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示布魯菌生長(zhǎng)速度減慢;耐受實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Δppdk對(duì)多粘菌素B和大牛血清的耐受能力降低,然而對(duì)雙氧水耐受能力同野毒相當(dāng);胞內(nèi)存活實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活能力降低,同動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中Δppdk對(duì)小鼠的致病力減弱的結(jié)果相符,表明ppdk基因也與布魯菌毒力密切相關(guān)。綜上,本研究通過(guò)構(gòu)建布魯菌碳代謝相關(guān)的Δpyk和Δppdk定向突變株,并測(cè)定缺失株主要的生物學(xué)特性變化,結(jié)果證明了pyk和ppdk是布魯菌毒力密切相關(guān)的基因,為布魯菌碳代謝與毒力關(guān)系的研究提供重要的理論研究資料,為布魯菌代謝缺陷型減毒活疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：流產(chǎn)布魯菌 丙酮酸激酶 丙酮酸磷酸雙激酶 毒力
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 第一章 引言12-20
• 1.1 布魯菌病的概述12
• 1.1.1 布魯菌病的流行12
• 1.1.2 布魯菌病原學(xué)特征12
• 1.2 布魯菌致病機(jī)制的研究進(jìn)展12-19
• 1.2.1 布魯菌逃避宿主免疫監(jiān)視12-13
• 1.2.2 布魯菌的胞內(nèi)移行途徑13-15
• 1.2.3 布魯菌主要的毒力因子簡(jiǎn)述15-17
• 1.2.4 布魯菌的效應(yīng)分子17-18
• 1.2.5 胞內(nèi)菌碳代謝與毒力關(guān)系的研究進(jìn)展18-19
• 1.3 本研究的目的和意義19-20
• 第二章 布魯菌pyk缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性分析20-32
• 2.1 材料與方法20-25
• 2.1.1 菌種與主要試劑20
• 2.1.2 主要儀器設(shè)備20
• 2.1.3 主要溶液的配制20-21
• 2.1.4 引物設(shè)計(jì)21
• 2.1.5 自殺質(zhì)粒和互補(bǔ)質(zhì)粒的構(gòu)建21-22
• 2.1.6 缺失株和互補(bǔ)株的構(gòu)建22
• 2.1.7 Western blot實(shí)驗(yàn)22-23
• 2.1.8 細(xì)菌RNA的提取及qRT-PCR的分析23
• 2.1.9 TSB培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線的測(cè)定23
• 2.1.10 耐受性實(shí)驗(yàn)23-24
• 2.1.11 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)24
• 2.1.12 胞內(nèi)存活實(shí)驗(yàn)24-25
• 2.1.13 對(duì)小鼠致病力分析25
• 2.2 結(jié)果25-30
• 2.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果25-26
• 2.2.2 缺失株和回復(fù)株構(gòu)建結(jié)果26
• 2.2.3 TSB培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果26-27
• 2.2.4 胞內(nèi)存活能力測(cè)定27-28
• 2.2.5 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-29
• 2.2.6 耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果29
• 2.2.7 對(duì)小鼠致病力分析結(jié)果29-30
• 2.3 討論30-32
• 第三章 布魯菌ppdk缺失株的構(gòu)建及生物學(xué)特性分析32-39
• 3.1 材料與方法32-34
• 3.1.1 質(zhì)粒、菌種及試劑32
• 3.1.2 引物設(shè)計(jì)32
• 3.1.3 自殺質(zhì)粒構(gòu)建32-33
• 3.1.4 缺失株的構(gòu)建33
• 3.1.5 細(xì)菌RNA的提取及qRT-PCR分析33
• 3.1.6 生長(zhǎng)曲線測(cè)定33
• 3.1.7 耐受性實(shí)驗(yàn)33-34
• 3.1.8 胞內(nèi)存活試驗(yàn)34
• 3.1.9 小鼠致病力分析34
• 3.2 結(jié)果34-37
• 3.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建34-35
• 3.2.2 缺失株構(gòu)建35
• 3.2.3 生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果35-36
• 3.2.4 胞內(nèi)存活試驗(yàn)分析36
• 3.2.5 耐受性試驗(yàn)結(jié)果36-37
• 3.2.6 缺失株對(duì)小鼠的致病力分析37
• 3.3 討論37-39
• 第四章 全文結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-50
• 致謝50-51
• 作者簡(jiǎn)歷51

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本文編號(hào)：840180