本文關(guān)鍵詞：兩種乳桿菌比較基因組學(xué)研究及細(xì)菌素生物合成基因功能解析

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【摘要】：乳桿菌是一類公認(rèn)的益生菌,對(duì)人體的健康有極大的促進(jìn)作用,如改善腸道菌群、增強(qiáng)免疫功能等。對(duì)乳桿菌的傳統(tǒng)研究大部分往往基于理化實(shí)驗(yàn)抑或動(dòng)物模型對(duì)其益生功能進(jìn)行評(píng)價(jià),而對(duì)內(nèi)在的益生機(jī)理研究較少。隨著基因組學(xué)的快速發(fā)展,測(cè)序技術(shù)不斷升級(jí)且測(cè)序成本迅速下降,采用基因組學(xué)的方法研究微生物的基因功能變得越來越有效。基因組學(xué)可以從基因水平上研究乳桿菌的益生機(jī)理,這將為人類深入認(rèn)識(shí)和了解乳桿菌揭開新的篇章。由于抗生素的廣泛大量使用甚至濫用,超級(jí)抗藥細(xì)菌越來越多,有必要發(fā)展新型抑菌物質(zhì)來替代或部分替代抗生素,而細(xì)菌素有良好的潛質(zhì),乳桿菌細(xì)菌素是目前研究較多的一類細(xì)菌素。傳統(tǒng)的細(xì)菌素研究方法大都從乳酸菌發(fā)酵液中分離純化出抑菌活性物質(zhì),并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)和抗菌活性等功能鑒定,此方法繁瑣且具有一定的隨機(jī)性。隨著越來越多的微生物基因組被測(cè)序,根據(jù)各類細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),采用生物信息學(xué)方法從微生物全基因組序列信息中挖掘潛在細(xì)菌素基因已成為新型細(xì)菌素開發(fā)越來越有效的技術(shù)之一。本研究采用第二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期從熱帶芒果果實(shí)中篩選到的具有優(yōu)良益生功能的一株植物乳桿菌L.plantarum FMNP01進(jìn)行全基因組測(cè)序,采用生物信息學(xué)方法對(duì)全基因組序列進(jìn)行分析,并將植物乳桿菌L.plantarum FMNP01的全基因組序列與實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)完成的全基因組測(cè)序的另一株乳桿菌L.sp FMNP02進(jìn)行比較基因組學(xué)分析,以揭示這兩株乳桿菌在分子進(jìn)化、細(xì)菌素生物合成、蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)、糖代謝方面的基因組學(xué)機(jī)理。同時(shí)。采用實(shí)驗(yàn)生物學(xué)方法對(duì)這兩株乳桿菌基因組中的潛在細(xì)菌素生物合成基因進(jìn)行功能解析和鑒定。主要研究結(jié)果如下:(1)植物乳桿菌L.plantarum FMNP01全基因組測(cè)序結(jié)果表明,FMNP01菌株的基因組大小為3,313,644 bp,GC含量44.48%,共4個(gè)Scaffolds,18個(gè)Contigs。預(yù)測(cè)基因組含有3,147個(gè)基因,總長(zhǎng)度為2,773,584 bp,占基因組全長(zhǎng)的83.70%,平均基因長(zhǎng)度881 bp,有64個(gè)tRNA,16個(gè)rRNA。(2)植物乳桿菌L.plantarum FMNP01和乳桿菌L.sp FMNP02的全基因組基本特征比較分析和基于16s rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹分析結(jié)果表明,這兩株乳桿菌的進(jìn)化關(guān)系在乳桿菌屬內(nèi)相對(duì)較遠(yuǎn),L.plantarum FMNP01與L.kimchii較為近緣,而L.sp FMNP02與L.casei較為近緣。(3)采用基因同源性和共線性分析方法對(duì)L.plantarum FMNP01和L.sp FMNP02進(jìn)行比較分析,結(jié)果顯示兩者僅僅有1459個(gè)基因具有同源性,L.plantarum FMNP01有1688個(gè)基因?yàn)槠涮赜?而L.sp FMNP02有1632個(gè)基因?yàn)槠涮赜?說明兩株乳桿菌之間的差異性較大,有近一半的基因?yàn)樽约禾赜谢颉９簿�性分析結(jié)果與基因同源性分析結(jié)果相符。(4)對(duì)L.plantarum FMNP01和L.sp FMNP02蛋白水解相關(guān)基因進(jìn)行比較分析,結(jié)果顯示L.sp FMNP02的肽類轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和肽酶數(shù)量均要多于L.plantarum FMNP01,推測(cè)L.sp FMNP02的蛋白水解能力要強(qiáng)于L.plantarum FMNP01。(5)對(duì)L.plantarum FMNP01和L.sp FMNP02的糖代謝相關(guān)基因進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)兩者均編碼大量的PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)蛋白,其中L.plantarum FMNP01編碼58個(gè),L.sp FMNP02編碼69個(gè)。對(duì)L.plantarum FMNP01和L.sp FMNP02的糖轉(zhuǎn)運(yùn)PTS系統(tǒng)蛋白的分類進(jìn)行了對(duì)比,結(jié)果顯示L.plantarum FMNP01和L.sp FMNP02的PTS系統(tǒng)蛋白存在較大差異。(6)對(duì)L.plantarum FMNP01植物乳桿菌素的細(xì)菌素生物合成相關(guān)基因簇進(jìn)行挖掘,發(fā)現(xiàn)L.plantarum FMNP01基因組中存在植物乳桿菌素的細(xì)菌素生物合成基因簇。該基因簇與植物乳桿菌WCFS1菌株的植物乳桿菌素生物合成基因簇對(duì)比分析結(jié)果表明,L.plantarumFMNP01的植物乳桿菌素生物合成基因簇比L.plantarumWCFS1菌株的植物乳桿菌素生物合成基因簇少了四個(gè)基因,分別是plnQ、plnI、plnF和plnS。采用大腸桿菌外源基因表達(dá)系統(tǒng)BL21[pET-32a(+)]表達(dá)L.plantarum FMNP01菌株的Ⅱb類細(xì)菌素植物乳桿菌素PlnJK,沒有抑菌活性。(7)對(duì)L.sp FMNP02進(jìn)行了Ⅱ類細(xì)菌素的基因挖掘,得到28個(gè)潛在的Ⅱ類細(xì)菌素基因序列。采用大腸桿菌外源基因表達(dá)系統(tǒng)BL21[pET-28a(+)]對(duì)L.sp FMNP02菌株基因組中潛在Ⅱb類細(xì)菌素基因序列F1和F2進(jìn)行表達(dá),F1基因表達(dá)產(chǎn)物F1-28a能夠抑制副溶血弧菌等,F2基因表達(dá)產(chǎn)物F2-28a能夠抑制大腸桿菌等。
【關(guān)鍵詞】：乳桿菌 全基因組測(cè)序 比較基因組學(xué) 細(xì)菌素 基因發(fā)掘
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q93
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 英文縮略語及中文對(duì)照8-13
• 1 緒論13-27
• 1.1 乳桿菌13-15
• 1.1.1 乳桿菌簡(jiǎn)介13
• 1.1.2 乳桿菌的活性功能13-15
• 1.1.3 乳桿菌的應(yīng)用15
• 1.2 乳桿菌基因組學(xué)研究現(xiàn)狀15-21
• 1.2.1 微生物基因組學(xué)簡(jiǎn)介15-17
• 1.2.2 微生物基因組學(xué)研究方法17-19
• 1.2.3 乳桿菌基因組學(xué)研究概況19-21
• 1.3 細(xì)菌素研究進(jìn)展21-25
• 1.3.1 細(xì)菌素簡(jiǎn)介與分類21-22
• 1.3.2 細(xì)菌素的抑菌機(jī)理22-23
• 1.3.3 細(xì)菌素的應(yīng)用23-24
• 1.3.4 乳酸菌細(xì)菌素研究概況24-25
• 1.4 本研究的目的與意義25-27
• 1.4.1 本研究的目的與意義25-26
• 1.4.2 研究?jī)?nèi)容26-27
• 2 L. plantarum FMNP01和L. sp FMNP02的比較基因組學(xué)研究及細(xì)菌素相關(guān)基因的挖掘27-54
• 2.1 研究對(duì)象及方法27-31
• 2.1.1 研究對(duì)象27
• 2.1.2 L. plantarum FMNP01的培養(yǎng)與基因組DNA的提取27
• 2.1.3 基因組測(cè)序、組裝及基因組注釋27
• 2.1.4 基因組同源性分析27-28
• 2.1.5 基因組共線性分析28
• 2.1.6 系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建28-29
• 2.1.7 細(xì)菌素基因挖掘方法29-30
• 2.1.8 所用到相關(guān)軟件和數(shù)據(jù)庫30-31
• 2.2 結(jié)果與分析31-51
• 2.2.1 L. plantarum FMNP01的全基因組測(cè)序及初步生物信息分析31-39
• 2.2.2 L. plantarum FMNP01和L. sp FMNP02基因組基本特征比較及系統(tǒng)分類39-41
• 2.2.3 L. plantarum FMNP01和L. sp FMNP02的基因組同源性比較41-45
• 2.2.4 L. plantarum FMNP01和L. sp FMNP02蛋白水解相關(guān)基因的比較分析45-48
• 2.2.5 L. plantarum FMNP01和L. sp FMNP02糖代謝相關(guān)基因的比較分析48-49
• 2.2.6 L. sp FMNP02細(xì)菌素相關(guān)基因的挖掘以及Ⅱ類細(xì)菌素的預(yù)測(cè)49-51
• 2.3 小結(jié)51-54
• 3 Pln J和Pln K原核表達(dá)菌株的構(gòu)建及表達(dá)54-67
• 3.1 材料與方法54-61
• 3.1.1 菌株與質(zhì)粒54
• 3.1.2 培養(yǎng)基和試劑54-55
• 3.1.3 主要儀器設(shè)備55
• 3.1.4 Pln J和Pln K的克隆55-59
• 3.1.5 誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)59-60
• 3.1.6 重組蛋白的純化及抑菌活性檢測(cè)60-61
• 3.2 結(jié)果與分析61-65
• 3.2.1 Pln J-T和Pln K-T克隆載體的構(gòu)建61-63
• 3.2.2 Pln J-p ET32a和Pln K-p ET32a表達(dá)載體的構(gòu)建63-64
• 3.2.3 重組大腸桿菌Pln J-p ET32a和Pln K-p ET32a的誘導(dǎo)表達(dá)64
• 3.2.4 重組蛋白Pln J-p ET32a和Pln K-p ET32a的純化及抑菌活性檢測(cè)64-65
• 3.3 小結(jié)65-67
• 4 F1和F2原核表達(dá)菌株的構(gòu)建及表達(dá)67-76
• 4.1 材料與方法67-71
• 4.1.1 菌株與質(zhì)粒67
• 4.1.2 培養(yǎng)基和試劑67
• 4.1.3 主要儀器設(shè)備67
• 4.1.4 F1和F2的克隆67-70
• 4.1.5 誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)70-71
• 4.1.6 重組蛋白的抑菌活性檢測(cè)71
• 4.2 結(jié)果與分析71-75
• 4.2.1 F1-T和F2-T克隆載體的構(gòu)建71-73
• 4.2.2 F1-p ET28a和F2-p ET28a表達(dá)載體的構(gòu)建73
• 4.2.3 重組大腸桿菌F1-p ET28a和F2-p ET28a的誘導(dǎo)表達(dá)73-74
• 4.2.4 重組蛋白F1-p ET28a和F2-p ET28a的抑菌活性檢測(cè)74-75
• 4.3 小結(jié)75-76
• 5 全文討論76-78
• 5.1 L. plantarum FMNP01與L. sp FMNP02的比較基因組學(xué)研究76
• 5.2 細(xì)菌素Pln J和Pln K的異源表達(dá)與活性驗(yàn)證76-77
• 5.3 Ⅱ類細(xì)菌素的預(yù)測(cè)與FI和F2的活性驗(yàn)證77-78
• 6 全文結(jié)論與展望78-80
• 6.1 全文結(jié)論78-79
• 6.2 展望79-80
• 致謝80-82
• 參考文獻(xiàn)82-93
• 附錄A L. plantarum FMNP01 PTS糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)93-97
• 附錄B L. sp FMNP02 PTS糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)97-101
• 附錄C 碩士在讀期間發(fā)表的文章101

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 林n，

本文編號(hào)：839001