發(fā)布時間：2017-09-12 16:22

  本文關(guān)鍵詞：候選轉(zhuǎn)基因靶標基因亞洲玉米螟絲氨酸蛋白酶抑制因子Serpin1突變體構(gòu)建及功能分析

  更多相關(guān)文章： 亞洲玉米螟 絲氨酸蛋白酶抑制因子 定點突變 原核表達 蛋白純化 抑制動力學(xué) 選擇性抑制

【摘要】：玉米是世界三大禾谷類作物之一,是重要的糧食、飼料和工業(yè)加工原料作物。近幾年,隨著我國玉米種植面積擴大和逐年連作,亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis的為害逐漸加重,嚴重影響玉米產(chǎn)量。目前,我國轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米研發(fā)工作正在進行中。絲氨酸蛋白酶抑制因子(Serine proteinase inhibitors, Serpins)是一種分布廣泛的家族型蛋白酶抑制劑,該家族的大多數(shù)成員都對絲氨酸蛋白酶具有特異性抑制。迄今為止,現(xiàn)己從動物、病毒、植物、細菌和古生菌中發(fā)現(xiàn)1500多類絲氨酸蛋白酶抑制因子,該類抑制因子一般含有350～400個氨基酸殘基,分子量約為40～100 kDa,并擁有一個包含8-9個a螺旋和3個p折疊的保守的三維結(jié)構(gòu)。絲氨酸蛋白酶抑制劑通常在C端有一段暴露的反應(yīng)中心(reactive centre loop)RCL序列,可以與絲氨酸蛋白酶共價結(jié)合,隨后Serpin自身被裂解,RCL區(qū)域P1位點的氨基酸在serpin的結(jié)合過程中起關(guān)鍵作用。本文以亞洲玉米螟免疫相關(guān)的絲氨酸蛋白酶抑制因子Serpin1為候選轉(zhuǎn)基因靶標基因,進行P1位點定點突變,構(gòu)建突變體并分析其表達產(chǎn)物的功能。本實驗室已克隆獲得Of-Serpin1全長為1336 bp的cDNA序列(登錄號：.X524148),含一個1188 bp的開放閱讀框,編碼395個氨基酸殘基,預(yù)測的分子量為43.3 kDa,其pI值為4.92,擁有一個典型的RCL功能區(qū)域。為探究P1位點在亞洲玉米螟serpin1功能中的作用,本文設(shè)計突變引物,將野生型P1位點的亮氨酸L360(CTA)突變?yōu)榫彼酭360(AGG)、賴氨酸K360(AAG)、苯丙氨酸F360(TTC)和絲氨酸S360(AGT),并在Serpin1氨基末端添加FLAG標簽。將野生型和四種突變體Of-Serpin1的ORF克隆于pET-28b表達載體中,之后轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)菌株進行體外原核表達。利用Ni2+親和柱對野生型及四種突變體Serpin 1 (R、K、F、S)重組蛋白進行親和純化,利用Western blotting鑒定純化獲得的蛋白。對野生型及四種突變體Serpin1(R、K、F、S)重組蛋白進行抑制動力學(xué)分析。結(jié)果表明：添加Of-Serpinl S360(AGT)后牛胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)的Vmax值和Km值最小,表示Of-Serpinl P1位點為S360時與chymotrypsin的親和力最大,親和力從大到小的Of-Serpin1 P1位點依次為S360K360p360L360R360。添加Of-serpin1 S360 (AGT)后chymotrypsin的K1值最小,表示Of-Serpin1 P1位點為S360時對chymotrypsin的抑制作用越強,抑制作用強度從大到小的Of-Serpin1 P1位點依次為S360K360F360L360R360。生物信息學(xué)分析表明Of-Serpin1類似于抗胰凝乳蛋白酶因子,但是Of-Serpin1野生型及四種突變體重組蛋白的選擇性剪切實驗結(jié)果證明,它們均可同時被牛胰凝乳蛋白酶和牛胰蛋白酶(.rypsin)剪切。
【關(guān)鍵詞】：亞洲玉米螟 絲氨酸蛋白酶抑制因子 定點突變 原核表達 蛋白純化 抑制動力學(xué) 選擇性抑制
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S435.132
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 文獻綜述8-19
• 1 轉(zhuǎn)基因玉米的研究現(xiàn)狀8
• 2 昆蟲的免疫防衛(wèi)系統(tǒng)8-9
• 3 酚氧化酶原激活系統(tǒng)9-10
• 4 轉(zhuǎn)基因候選基因絲氨酸蛋白酶抑制因子10-15
• 5 研究目的和意義15
• 參考文獻15-19
• 1 前言19-20
• 2 材料與方法20-30
• 2.1 主要試劑20
• 2.2 主要儀器20-21
• 2.3 cDNA模板制備21-22
• 2.4 亞洲玉米螟幼蟲Of-Serpin1基因突變體的構(gòu)建22-27
• 2.4.1 系統(tǒng)進化樹和多重序列比對確定P1位點22
• 2.4.2 引物設(shè)計與合成22
• 2.4.3 Of-Serpin1四種突變體基因的PCR擴增22-25
• 2.4.4 目的基因片段的回收純化25
• 2.4.5 感受態(tài)細胞BL21的制備(CaCl_2法)25
• 2.4.6 Of-Serpin1四種突變體基因與表達載體連接25-27
• 2.4.7 Of-Serpin1四種突變體基因測序鑒定測序鑒定27
• 2.5 Of-Serpin1突變體(R、K、F、S)重組蛋白的原核表達27-30
• 2.5.1 重組表達條件優(yōu)化27-28
• 2.5.2 表達的融合蛋白的純化28-29
• 2.5.3 表達蛋白的Western blotting鑒定29-30
• 2.6 重組表達蛋白Of-Serpin1突變體蛋白的功能分析30
• 2.6.1 Of-Serpin1的抑制動力學(xué)30
• 2.6.2 不同絲氨酸蛋白酶對重組表達突變體蛋白Of-Serpin1的剪切活性分析30
• 3 結(jié)果與分析30-53
• 3.1 亞洲玉米螟幼蟲Of-Serpinl基因序列分析及P1位點確定30-33
• 3.1.1 系統(tǒng)進化樹和多重序列比對確定P1位點30-33
• 3.2 亞洲玉米螟幼蟲Of-Serpin1突變體基因原核表達載體的構(gòu)建33-38
• 3.2.1 引物設(shè)計與合成33
• 3.2.2 Of-Serpin1四種P1位點突變體基因全長cDNA的克隆33-35
• 3.2.3 Of-Serpin1突變體PCR產(chǎn)物割膠回收及表達載體構(gòu)建35-36
• 3.2.4 Of-Serpin1(P1,R、K、F、S)四種突變體測序鑒定36-38
• 3.3 四種pET-28b-Of-Serpin1(P1,R、K、F、S)突變體原核表達條件的篩選38-40
• 3.4 Of-Serpin1突變體(R、K、F、S)重組蛋白的純化與Western blotting鑒定40-42
• 3.5 重組表達蛋白Of-Serpin1野生型及突變體蛋白的功能分析42-53
• 3.5.1 重組表達蛋白Of-Serpin1野生型及其四種突變體(R、K、F、S)蛋白酶動力學(xué)分析42-50
• 3.5.2 不同絲氨酸蛋白酶對重組表達蛋白Of-Serpin1野生型及突變體蛋白的剪切活性分析50-53
• 4 討論53-60
• 4.1 Of-Serpin1野生型和突變體的氨基酸序列和蛋白結(jié)構(gòu)53-54
• 4.2 Of-Serpin1野生型和突變體蛋白的底物特異性54-55
• 4.3 Of-Serpin1的原核表達、純化及Western blotting分析55-57
• 4.4 Of-Serpin1基因的蛋白功能57-60
• 4.4.1 體外重組蛋白Of-Serpin1的酶動力學(xué)分析57-58
• 4.4.2 不同絲氨酸蛋白酶對重組表達蛋白Of-Serpin1野生型和四種突變體蛋白的剪切活性分析58-60
• 參考文獻60-63
• 致謝63-64
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文64-65

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