發(fā)布時間：2017-09-11 11:19

  本文關鍵詞：煙草orf25、atp9基因的RNAi載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

  更多相關文章： 煙草 orf25基因 atp9基因 RNAi 遺傳轉(zhuǎn)化

【摘要】：雜種優(yōu)勢的利用可以有效地使煙草實現(xiàn)高產(chǎn)、高抗、優(yōu)質(zhì)的育種目標。目前,培育雄性不育系是獲取雜種煙草最有效的途徑。本文以煙草雄性不育相關基因orf25和atp9為對象,通過RNA干擾技術,分別構(gòu)建了煙草orf25、atp9基因的RNAi表達載體pCAMBIA1301-orf25-RNAi和pCAMBIA1301-atp9-RNAi,并通過農(nóng)桿菌介導煙草遺傳轉(zhuǎn)化技術獲得轉(zhuǎn)基因煙草苗,以探討煙草雄性不育相關基因orf25、atp9的功能及其在煙草雄性不育形成中的作用,為選育煙草雄性不育系植株奠定基礎。主要研究結(jié)果如下:1、煙草orf25、atp9基因干擾片段的獲得:依據(jù)實驗室保存的orf25、atp9基因全長cDNA序列,分別設計特異性引物,擴增orf25、atp9基因的正、反義干擾片段:orf25基因擴增片段為606bp,atp9基因擴增片段為239bp。2、煙草orf25、atp9基因的RNAi表達載體的構(gòu)建:根據(jù)RNAi表達載體構(gòu)建原則,將長度為606bp的orf25基因的正、反向干擾片段插入到大小為190bp的linker片段的兩側(cè),長度為239bp的atp9基因的正、反向干擾片段插入到linker片段的兩側(cè),分別構(gòu)成含linker間隔片段穩(wěn)定發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA干擾片段。以pET30a和pCAMBIA1301為橋梁載體,成功的構(gòu)建orf25、atp9基因的RNA干擾表達載體pCAMBIA1301-orf25-RNAi和pCAMBIA1301-atp9-RNAi。3、煙草遺傳轉(zhuǎn)化條件的建立:農(nóng)桿菌GV3101侵染煙草葉片最適宜的侵染濃度OD600值為0.5;最適宜的侵染時間為8分鐘;煙草預培養(yǎng)最佳時間為3天;侵染后28℃暗培養(yǎng)最佳時間為3天;抗性篩選物卡那霉素最佳濃度為80 mg/L;農(nóng)桿菌抑制劑頭孢霉素的最佳濃度為400 mg/L。4、煙草轉(zhuǎn)基因苗的獲得:利用農(nóng)桿菌介導法將pCAMBIA1301-orf25-RNAi和pCAMBIA1301-atp9-RNAi分別轉(zhuǎn)入煙草保持系中煙90中,經(jīng)抗性篩選以及分子檢測最終獲得35株轉(zhuǎn)pCAMBIA1301-orf25-RNAi煙草植株,其中陽性煙草有18株,轉(zhuǎn)化率為51.4%;獲得41株轉(zhuǎn)pCAMBIA1301-atp9-RNAi煙草植株,其中陽性煙草有20株,轉(zhuǎn)化率為48.8%。
【關鍵詞】：煙草 orf25基因 atp9基因 RNAi 遺傳轉(zhuǎn)化
【學位授予單位】：江西農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S572;Q943.2
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-8
• 第一章 文獻綜述8-20
• 1 植物雄性不育性研究8-10
• 1.1 細胞核雄性不育(GMS)相關基因研究8-9
• 1.2 細胞質(zhì)雄性不育(CMS)相關基因研究9
• 1.3 orf25基因研究現(xiàn)狀9-10
• 1.4 atp9基因研究現(xiàn)狀10
• 2 RNA干擾技術及其在煙草中的應用研究10-14
• 2.1 RNA干擾的作用機制11
• 2.2 RNA干擾的特點11-12
• 2.3 RNA干擾技術在煙草中的應用12-14
• 2.3.1 RNA干擾技術在煙草基因功能研究中的應用12
• 2.3.2 RNA干擾技術在煙草抗病研究中的應用12-13
• 2.3.3 RNA干擾技術在煙草蟲害防治研究中的應用13-14
• 2.3.4 RNA干擾技術在煙草品質(zhì)改良研究中的應用14
• 3 煙草遺傳轉(zhuǎn)化技術14-18
• 3.1 植物基因工程的現(xiàn)狀14-15
• 3.2 植物基因工程的前景15
• 3.3 農(nóng)桿菌介導煙草遺傳轉(zhuǎn)化法15-17
• 3.4 DNA直接導入煙草法17
• 3.5 基因槍法17
• 3.6 電擊法17
• 3.7 花粉管通道法17-18
• 4 本研究的目的和意義18
• 5 研究內(nèi)容和技術路線18-20
• 第二章 材料與方法20-31
• 1 實驗材料20-22
• 1.1 植物材料20
• 1.2 菌株和質(zhì)粒20
• 1.3 主要儀器設備20
• 1.4 主要實驗試劑20
• 1.5 培養(yǎng)基以及抗生素的配置20-22
• 2 實驗方法22-31
• 2.1 煙草orf25、atp9基因RNAi載體構(gòu)建22-27
• 2.1.1 引物設計22
• 2.1.2 目的基因干擾片段的擴增及回收22-23
• 2.1.3 連接T載體23-24
• 2.1.4 構(gòu)建pET30a-orf25(+)、pET30a-atp9(+)24-25
• 2.1.5 構(gòu)建pET30a-orf25(+)-linker、pET30a-atp9(+)-linker25-26
• 2.1.6 構(gòu)建pET30a-orf25(+)-linker-orf25(-)26
• 2.1.7 構(gòu)建pET30a-atp9(+)-linker-atp9(-)26
• 2.1.8 構(gòu)建pCAMBIA1301-orf25-RNAi、pCAMBIA1301-atp9-RNAi26-27
• 2.2 RNAi表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌27-28
• 2.2.1 農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備27
• 2.2.2 質(zhì)粒DNA直接導入農(nóng)桿菌27-28
• 2.2.3 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的鑒定28
• 2.3 農(nóng)桿菌介導煙草遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建及優(yōu)化28-30
• 2.3.1 葉盤法轉(zhuǎn)化煙草28-29
• 2.3.2 外植體預培養(yǎng)時間的確定29
• 2.3.3 卡那霉素濃度的篩選29
• 2.3.4 菌液濃度及侵染時間的確定29
• 2.3.5 共培養(yǎng)時間的確定29
• 2.3.6 頭孢霉素濃度的篩選29
• 2.3.7 轉(zhuǎn)基因煙草植株的獲得29-30
• 2.4 轉(zhuǎn)基因煙草植株的檢測30-31
• 第三章 結(jié)果與分析31-44
• 1 orf25、atp9基因RNAi載體構(gòu)建31-36
• 1.1 基因片段的PCR擴增31
• 1.2 pET30a-orf25(+)、pET30a-atp9(+)的構(gòu)建及鑒定31-32
• 1.3 pET30a-orf25(+)-linker、pET30a-atp9(+)-linker的構(gòu)建及鑒定32-33
• 1.4 pET30a-orf25(+)-linker-orf25(-)的構(gòu)建及鑒定33-34
• 1.5 pET30a-atp9(+)-linker-atp9(-)的構(gòu)建及鑒定34
• 1.6 pCAMBIA1301-orf25-RNAi的構(gòu)建及鑒定34-35
• 1.7 pCAMBIA1301-atp9-RNAi的構(gòu)建及鑒定35-36
• 2 RNAi表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的鑒定36-37
• 3 煙草遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化37-40
• 3.1 外植體預培養(yǎng)時間的確定37
• 3.2 卡那霉素濃度的篩選37-38
• 3.3 菌液濃度及侵染時間的確定38-39
• 3.4 共培養(yǎng)時間的確定39-40
• 3.5 頭孢霉素濃度的篩選40
• 4 轉(zhuǎn)基因煙草植株的獲得40-41
• 5 轉(zhuǎn)基因煙草PCR檢測41-44
• 結(jié)論44-45
• 討論45-48
• 1 RNA干擾載體的構(gòu)建45
• 2 根癌農(nóng)桿菌介導煙草遺傳轉(zhuǎn)化45-46
• 2.1 卡那霉素篩選濃度的確定45-46
• 2.2 煙草葉片的選擇46
• 2.3 農(nóng)桿菌的抑制46
• 3 下一步的研究設想46-48
• 參考文獻48-56
• 致謝56

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