本文關(guān)鍵詞：煙草根系鉀通道基因NTORK1的功能及調(diào)控研究

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【摘要】：為研究煙草鉀通道基因NTORK1是否受激素調(diào)控,參與調(diào)節(jié)根系的鉀外流,利用p BI121和p ER8(含XVE系統(tǒng))為骨架載體,分別構(gòu)建了NTORK1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS的表達(dá)載體和受ES誘導(dǎo)啟動(dòng)NTORK1的RNAi表達(dá)載體。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化和穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化,分別研究了NTORK1啟動(dòng)子和NTORK1基因的功能。獲得的結(jié)果如下:1、使用不同濃度SA和NAA處理低鉀Hoagland培養(yǎng)液培養(yǎng)的煙草K326植株,然后檢測(cè)植株根外鉀離子含量變化,同時(shí)使用Real-time PCR分析NTORK1基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示,50μmol/L SA能抑制根鉀離子外流;500μmol/L SA能誘導(dǎo)根鉀離子外流,并誘導(dǎo)NTORK1基因的表達(dá)。2、構(gòu)建了NTORK-GUS表達(dá)載體。以p BI121載體為基礎(chǔ),克隆NTORK1基因上游2111bp片段替換原載體上的35S啟動(dòng)子。構(gòu)建了NTORK1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因表達(dá)載體p BI121-NTORK。3、通過煙葉瞬時(shí)轉(zhuǎn)化p BI121-NTORK表達(dá)載體和不同激素處理。結(jié)果顯示,NTORK啟動(dòng)子受5.4μmol/L NAA和500μmol/L SA的誘導(dǎo)表達(dá)。4、構(gòu)建了NTORK1的RNAi表達(dá)載體。以p ER8載體為基礎(chǔ),在多克隆位點(diǎn)插入NTORK1基因的RNAi片段、Tnos終止子、DR5啟動(dòng)子和GUS。其中RNAi片段來自NTORK1基因3’端250bp片段和actin內(nèi)含子。5、通過葉盤穩(wěn)定轉(zhuǎn)化NTORK1的RNAi表達(dá)載體,獲得大量潮霉素抗性苗。經(jīng)PCR鑒定獲得多株轉(zhuǎn)基因陽性苗。使用5μmol/L 17-β-雌二醇(Es)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植株,Real-time PCR結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草NTORK1的表達(dá)被抑制,抑制率最高達(dá)到90%。6、使用含5μmol/L 17-β-雌二醇的低鉀Hoagland培養(yǎng)液對(duì)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因煙草水培3d。然后在分別含5μmol/L Es、5μmol/L Es+50μmol/L SA、5μmol/L Es+500μmol/L SA的無鉀Hoagland培養(yǎng)液中各處理40min。通過檢測(cè)培養(yǎng)液的鉀離子濃度,以及葉片NTORK1基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示,在Es+500μmol/L SA培養(yǎng)液中,轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因植株的NTORK1表達(dá)量比在Es+50μmol/L SA處理中增加,同時(shí)轉(zhuǎn)基因植株的培養(yǎng)液鉀離子含量明顯低于非轉(zhuǎn)基因植株。以上說明,NTORK1受SA調(diào)控,介導(dǎo)煙草根系的鉀離子外流,500μmol/L的SA能誘導(dǎo)NTORK1表達(dá)并增加培養(yǎng)液的鉀離子含量,而50μmol/L SA的效果相反。最終,獲得的研究結(jié)論如下:1.高濃度SA和低濃度NAA能誘導(dǎo)NTORK1表達(dá);2.高濃度SA能誘導(dǎo)根鉀外流,低濃度SA抑制根鉀外流;3.NTORK1介導(dǎo)鉀離子外流,并且受SA調(diào)控。本研究首次將植物激素、NTORK1和根鉀外流聯(lián)系在一起,為改善煙草鉀含量提供了理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：煙草 鉀通道 NTORK1 植物激素 轉(zhuǎn)基因 RNAi
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S572;Q943.2
【目錄】：

• 縮略詞表5-7
• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 第一章 前言11-23
• 1.1 植物鉀離子的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)與調(diào)節(jié)11-15
• 1.1.1 低親和性鉀離子吸收系統(tǒng)11-13
• 1.1.2 高親和性鉀離子吸收系統(tǒng)13-15
• 1.2 鉀離子外流15-21
• 1.2.1 根鉀離子外流是響應(yīng)脅迫的正常反應(yīng)15-18
• 1.2.2 鉀離子外流通道18-20
• 1.2.3 組成型鉀離子通道的功能20-21
• 1.3 煙草鉀離子外流通道NTORK1與植物激素21-22
• 1.4 研究目的和意義22-23
• 第二章 激素對(duì)NTORK1啟動(dòng)子的誘導(dǎo)分析23-42
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑23
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料23
• 2.1.2 主要試劑23
• 2.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器23-24
• 2.3 主要溶液的配置24-27
• 2.3.1 主要培養(yǎng)基的配置24-26
• 2.3.2 試劑的配置26-27
• 2.3.3 引物序列27
• 2.4 實(shí)驗(yàn)方法27-33
• 2.4.1 NAA和SA處理煙草測(cè)植物根鉀離子外流27-28
• 2.4.2 qPCR檢測(cè)激素處理煙草根基因表達(dá)28-29
• 2.4.3 NTORK1的啟動(dòng)子克隆及激素誘導(dǎo)分析29-33
• 2.5 結(jié)果與分析33-42
• 2.5.1 SA和NAA處理非轉(zhuǎn)基因K326煙草33-36
• 2.5.2 NTORK1的啟動(dòng)子克隆及激素誘導(dǎo)分析36-42
• 第三章 NTORK1基因RNAi表達(dá)載體42-65
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑42
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料`42
• 3.1.2 主要試劑42
• 3.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器42
• 3.3 主要溶液的配置42-46
• 3.3.1 主要培養(yǎng)基的配置42-45
• 3.3.2 試劑的配置45
• 3.3.3 引物序列45-46
• 3.4 實(shí)驗(yàn)方法46-56
• 3.4.1 pER8-A-GUS表達(dá)載體的構(gòu)建46-49
• 3.4.2 遺傳轉(zhuǎn)化煙草K32649-54
• 3.4.3 NTORK1基因功能驗(yàn)證54-56
• 3.5 結(jié)果與分析56-65
• 3.5.1 pER8-A-GUS表達(dá)載體構(gòu)建56-60
• 3.5.2 遺傳轉(zhuǎn)化煙草K32660-63
• 3.5.3 NTORK1基因功能驗(yàn)證63-65
• 第四章 討論65-67
• 4.1 水楊酸對(duì)NTORK1基因的影響65
• 4.2 生長(zhǎng)素對(duì)NTORK1基因的影響65
• 4.3 水楊酸、NTORK1與鉀外流關(guān)聯(lián)65-67
• 第五章 總結(jié)與展望67-68
• 5.1 結(jié)論67
• 5.2 展望67-68
• 致謝68-70
• 參考文獻(xiàn)70-79
• 附錄79-80

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本文編號(hào)：827267