本文關鍵詞：四種乳酸菌中低聚糖合成相關的基因的挖掘及其功能研究

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【摘要】：隨著中國經濟高速發(fā)展,人們生活水平的提高,對環(huán)境和健康的日益重視,食品安全問題儼然成為全社會關注的焦點,崇尚綠色,回歸自然的飲食觀念也隨之形成,功能性低聚糖和蛋氨酸因其功能的多樣性和獨特性而備受關注。腸道微生態(tài)的紊亂是影響人們或動物健康水平的最主要原因之一,功能性低聚糖進入體內后不能被吸收,但能被腸道益生菌利用而大量增殖,抑制病原微生物的生長,改善微生態(tài)環(huán)境;蛋氨酸是人體必需的氨基酸,需求量較少,但蛋氨酸及其代謝產物可參與機體新陳代謝,提高機體免疫力和抗氧化能力,減少對抗生素等的依賴。伴隨著生物技術步入21世紀,測序技術不斷的發(fā)展,第二代測序因其通量大、精度高、信息量豐富的特點而被廣泛的使用,而基于第二代全基因組測序的功能基因挖掘手段也逐漸成為研究的焦點。生物體的全基因組所承載的遺傳信息包含巨大潛在的研究與經濟價值,對其進行功能基因的挖掘成為重要的利用手段。因此,選取與合成功能性低聚糖和蛋氨酸的有關的酶類為驗證對象,采用該方式對本課題組自主篩得的植物乳桿菌和干酪乳桿菌的全基因組測序信息,以及NCBI數據庫上傳的乳酸菌全基因組信息進行生物信息學分析來挖掘功能基因。本研究通過生物信息學的方法從乳酸菌的全基因組序列信息中挖掘出與功能性低聚糖合成相關的酶,α-葡萄糖基轉移酶(α-GTF-pla、α-GTF-cas、α-GTF-bre),鼠李糖基轉移酶(RHLase),β-呋喃果糖苷酶(β-FFase),蔗糖磷酸化酶(SPase);與蛋氨酸合成相關的酶,高絲氨酸-O-琥珀酰轉移酶(MetA),通過PCR的方法克隆得到相應基因,成功構建大腸桿菌表達系統(tǒng),但除β-呋喃果糖苷酶,蔗糖磷酸化酶外均生成包涵體。對α-GTF-pla進行誘導條件優(yōu)化和復性未獲得可溶性蛋白時,構建其乳酸乳球菌表達系統(tǒng)獲得了其可溶性表達。功能驗證結果表明,α-GTF-pla與β-呋喃果糖苷酶不具備其對應分解蔗糖的能力,蔗糖磷酸化酶則與其功能相對應。表明基于全基因組信息進行生物信息學分析來挖掘功能基因存在一些局限性。利用蔗糖磷酸化酶合成功能性低聚糖,進行酶學性質研究及底物篩選,僅D-半乳糖,麥芽糖和蔗糖能形成明顯的低聚糖,與已知的蔗糖磷酸化酶受體范圍存在一定差異性。利用D-半乳糖和蔗糖合成蜜二糖,進行條件優(yōu)化和響應面分析,在底物濃度為60%,底物比例為1:2,反應溫度為40℃,加純化酶量為400μL(0.39 U/L)的條件下反應24h,可獲得最高蜜二糖的產量為34.20±0.92 g/L。
【關鍵詞】：乳酸菌 全基因組 基因挖掘 表達驗證
【學位授予單位】：華南農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q811.4;TS201.3
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-11
• 1 前言11-33
• 1.1 功能性低聚糖研究進展11-21
• 1.1.1 低聚糖的功能11-13
• 1.1.2 常見功能性低聚糖的種類13-14
• 1.1.3 功能性低聚糖的應用14-15
• 1.1.4 合成方式15-21
• 1.2 蛋氨酸研究進展21-30
• 1.2.1 蛋氨酸的性質21-22
• 1.2.2 生理功能22-23
• 1.2.3 吸收與代謝途徑23-26
• 1.2.4 蛋氨酸的應用26-27
• 1.2.5 蛋氨酸生產27-29
• 1.2.6 高產蛋氨酸菌株的構建29-30
• 1.3 功能基因的挖掘30-32
• 1.3.1 基因組學介紹31
• 1.3.2 乳酸菌基因組學研究31-32
• 1.4 本研究的目的和意義32-33
• 2 材料與方法33-59
• 2.1 材料33-37
• 2.1.1 菌株和質粒33
• 2.1.2 培養(yǎng)基及試劑配制33-35
• 2.1.3 酶與試劑35-36
• 2.1.4 主要儀器設備36
• 2.1.5 試劑盒36
• 2.1.6 分子量標準36-37
• 2.2 方法37-59
• 2.2.1 功能基因的挖掘37
• 2.2.2 引物設計37-39
• 2.2.3 ɑ-GTF-pla基因的克隆39-44
• 2.2.4 ɑ-GTF-pla的表達表達驗證44-53
• 2.2.4.1 重組表達載體的構建44-47
• 2.2.4.2 重組表達載體的轉化E.coli DH5α47
• 2.2.4.3 重組表達載體的篩選與鑒定47-48
• 2.2.4.4 重組表達載體轉化 BL2148
• 2.2.4.5 重組大腸桿菌的誘導表達48
• 2.2.4.6 誘導表達產物SDS-PAGE分析48-49
• 2.2.4.7 α-GTF酶活檢測49-50
• 2.2.4.8 重組蛋白含量的測定50
• 2.2.4.9 誘導表達產物的純化50
• 2.2.4.10 包涵體復性50-51
• 2.2.4.11 α-GTF-pla的表達條件優(yōu)化51-52
• 2.2.4.12 α-GTF-pla在乳酸乳球菌中的表達52-53
• 2.2.5 α-GTF-cas的克隆與表達驗證53-54
• 2.2.6 α-GTF-bre的克隆與表達驗證54
• 2.2.7 FFase-pla的克隆及表達驗證54-55
• 2.2.8 RHL的克隆與表達驗證55
• 2.2.9 metA的克隆與表達驗證55
• 2.2.10 SPase在大腸桿菌中的表達驗證55-57
• 2.2.11 SPase合成功能性低聚糖研究57-59
• 3 結果與分析59-101
• 3.1 功能基因的挖掘59-61
• 3.1.1 全基因組測序挖掘功能基因59-61
• 3.1.2 數據庫中 α-GTF的挖掘61
• 3.2 引物設計61-62
• 3.3 α-gtf-pla基因的克隆62-68
• 3.3.1 植物乳桿菌基因組DNA的提取62
• 3.3.2 α-GTF-pla的PCR擴增與產物檢測62-63
• 3.3.3 α-gtf-pla基因PCR產物的回收63
• 3.3.4 植物乳桿菌 α-gtf-pla基因PCR產物測序63-64
• 3.3.5 克隆載體 α-gtf-pla/pMD-18T構建與鑒定64
• 3.3.6 α-gtf-pla完整序列的生物信息學分析64-68
• 3.4 α-gtf-pla基因的表達驗證68-73
• 3.4.1 α-GTF-pla基因表達載體的構建與鑒定68-69
• 3.4.2 α-GTF-pla基因的表達與分析69
• 3.4.3 α-GTF-pla包涵體的復性69-70
• 3.4.4 α-GTF-pla表達條件的優(yōu)化70-71
• 3.4.5 α-GTF-pla在乳酸乳球中的表達驗證71-73
• 3.5 α-gtf-cas基因的克隆與表達驗證73-77
• 3.5.1 干酪乳桿菌 α-GTF基因的克隆73-74
• 3.5.2 表達載體 α-gtf-cas/pET-32a的構建74-75
• 3.5.3 α-gtf-cas基因在大腸桿菌中的表達75-76
• 3.5.4 表達載體 α-gtf-cas/pBM02的構建76-77
• 3.6 α-gtf-bre基因的克隆與表達驗證77-79
• 3.6.1 α-gtf-bre基因的克隆77-78
• 3.6.2 表達載體 α-gtf-bre/pET-32a的構建78
• 3.6.3 α-gtf-bre基因在大腸桿菌中的表達驗證78-79
• 3.7 三株乳酸菌中 α-gtf基因的比較分析79-80
• 3.8 FFase基因的克隆與表達驗證80-83
• 3.8.1 FFase基因的克隆80-81
• 3.8.2 表達載體FFase/pET-32a的構建81-82
• 3.8.3 FFase基因在大腸桿菌中的表達驗證82-83
• 3.9 RHL基因的克隆與表達驗證83-85
• 3.9.1 RHL基因的克隆83-84
• 3.9.2 表達載體RHL/pET-32a的構建84
• 3.9.3 RHL基因在大腸桿菌中的表達驗證84-85
• 3.10 MetA基因的克隆與表達驗證85-87
• 3.10.1 MetA基因的克隆85-86
• 3.10.2 MetA基因表達載體MetA/pET-32a的構建86
• 3.10.3 MetA基因在大腸桿菌中的表達驗證86-87
• 3.11 SPase基因的克隆與表達驗證87-90
• 3.11.1 SPase基因的克隆87-88
• 3.11.2 表達載體SPase/pET-32a的構建88-89
• 3.11.3 SPase基因在大腸桿菌中的表達驗證89
• 3.11.4 SPase的純化分析89-90
• 3.11.5 SPase酶活測定90
• 3.12 SPase酶學性質研究90-94
• 3.12.1 SPase最適反應溫度90-91
• 3.12.2 酶的最適反應pH91
• 3.12.3 金屬離子對SPase酶活的影響91-92
• 3.12.4 溫度對SPase穩(wěn)定性的影響92-93
• 3.12.5 pH對SPase穩(wěn)定性的影響93
• 3.12.6 SPase酶反應常數測定93-94
• 3.13 SPase合成功能性低聚糖94-101
• 3.13.1 SPase合成功能性低聚糖底物的篩選94-95
• 3.13.2 蜜二糖合成條件的影響95-98
• 3.13.3 正交分析98-101
• 4 討論與結論101-108
• 4.1 討論101-107
• 4.1.1 基因挖掘與驗證101-102
• 4.1.2 大腸桿菌表達系統(tǒng)中包涵體的形成102-104
• 4.1.3 乳酸菌表達系統(tǒng)104-106
• 4.1.4 SPase合成功能性低聚糖106-107
• 4.2 結論107-108
• 致謝108-109
• 參考文獻109-121
• 附錄121

【參考文獻】

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本文編號：820188