本文關(guān)鍵詞：四種乳酸菌中低聚糖合成相關(guān)的基因的挖掘及其功能研究

  更多相關(guān)文章： 乳酸菌 全基因組 基因挖掘 表達(dá)驗(yàn)證

【摘要】：隨著中國(guó)經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展,人們生活水平的提高,對(duì)環(huán)境和健康的日益重視,食品安全問(wèn)題儼然成為全社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn),崇尚綠色,回歸自然的飲食觀念也隨之形成,功能性低聚糖和蛋氨酸因其功能的多樣性和獨(dú)特性而備受關(guān)注。腸道微生態(tài)的紊亂是影響人們或動(dòng)物健康水平的最主要原因之一,功能性低聚糖進(jìn)入體內(nèi)后不能被吸收,但能被腸道益生菌利用而大量增殖,抑制病原微生物的生長(zhǎng),改善微生態(tài)環(huán)境;蛋氨酸是人體必需的氨基酸,需求量較少,但蛋氨酸及其代謝產(chǎn)物可參與機(jī)體新陳代謝,提高機(jī)體免疫力和抗氧化能力,減少對(duì)抗生素等的依賴。伴隨著生物技術(shù)步入21世紀(jì),測(cè)序技術(shù)不斷的發(fā)展,第二代測(cè)序因其通量大、精度高、信息量豐富的特點(diǎn)而被廣泛的使用,而基于第二代全基因組測(cè)序的功能基因挖掘手段也逐漸成為研究的焦點(diǎn)。生物體的全基因組所承載的遺傳信息包含巨大潛在的研究與經(jīng)濟(jì)價(jià)值,對(duì)其進(jìn)行功能基因的挖掘成為重要的利用手段。因此,選取與合成功能性低聚糖和蛋氨酸的有關(guān)的酶類為驗(yàn)證對(duì)象,采用該方式對(duì)本課題組自主篩得的植物乳桿菌和干酪乳桿菌的全基因組測(cè)序信息,以及NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上傳的乳酸菌全基因組信息進(jìn)行生物信息學(xué)分析來(lái)挖掘功能基因。本研究通過(guò)生物信息學(xué)的方法從乳酸菌的全基因組序列信息中挖掘出與功能性低聚糖合成相關(guān)的酶,α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(α-GTF-pla、α-GTF-cas、α-GTF-bre),鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶(RHLase),β-呋喃果糖苷酶(β-FFase),蔗糖磷酸化酶(SPase);與蛋氨酸合成相關(guān)的酶,高絲氨酸-O-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶(MetA),通過(guò)PCR的方法克隆得到相應(yīng)基因,成功構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),但除β-呋喃果糖苷酶,蔗糖磷酸化酶外均生成包涵體。對(duì)α-GTF-pla進(jìn)行誘導(dǎo)條件優(yōu)化和復(fù)性未獲得可溶性蛋白時(shí),構(gòu)建其乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)獲得了其可溶性表達(dá)。功能驗(yàn)證結(jié)果表明,α-GTF-pla與β-呋喃果糖苷酶不具備其對(duì)應(yīng)分解蔗糖的能力,蔗糖磷酸化酶則與其功能相對(duì)應(yīng)。表明基于全基因組信息進(jìn)行生物信息學(xué)分析來(lái)挖掘功能基因存在一些局限性。利用蔗糖磷酸化酶合成功能性低聚糖,進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究及底物篩選,僅D-半乳糖,麥芽糖和蔗糖能形成明顯的低聚糖,與已知的蔗糖磷酸化酶受體范圍存在一定差異性。利用D-半乳糖和蔗糖合成蜜二糖,進(jìn)行條件優(yōu)化和響應(yīng)面分析,在底物濃度為60%,底物比例為1:2,反應(yīng)溫度為40℃,加純化酶量為400μL(0.39 U/L)的條件下反應(yīng)24h,可獲得最高蜜二糖的產(chǎn)量為34.20±0.92 g/L。
【關(guān)鍵詞】：乳酸菌 全基因組 基因挖掘 表達(dá)驗(yàn)證
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q811.4;TS201.3
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-11
• 1 前言11-33
• 1.1 功能性低聚糖研究進(jìn)展11-21
• 1.1.1 低聚糖的功能11-13
• 1.1.2 常見功能性低聚糖的種類13-14
• 1.1.3 功能性低聚糖的應(yīng)用14-15
• 1.1.4 合成方式15-21
• 1.2 蛋氨酸研究進(jìn)展21-30
• 1.2.1 蛋氨酸的性質(zhì)21-22
• 1.2.2 生理功能22-23
• 1.2.3 吸收與代謝途徑23-26
• 1.2.4 蛋氨酸的應(yīng)用26-27
• 1.2.5 蛋氨酸生產(chǎn)27-29
• 1.2.6 高產(chǎn)蛋氨酸菌株的構(gòu)建29-30
• 1.3 功能基因的挖掘30-32
• 1.3.1 基因組學(xué)介紹31
• 1.3.2 乳酸菌基因組學(xué)研究31-32
• 1.4 本研究的目的和意義32-33
• 2 材料與方法33-59
• 2.1 材料33-37
• 2.1.1 菌株和質(zhì)粒33
• 2.1.2 培養(yǎng)基及試劑配制33-35
• 2.1.3 酶與試劑35-36
• 2.1.4 主要儀器設(shè)備36
• 2.1.5 試劑盒36
• 2.1.6 分子量標(biāo)準(zhǔn)36-37
• 2.2 方法37-59
• 2.2.1 功能基因的挖掘37
• 2.2.2 引物設(shè)計(jì)37-39
• 2.2.3 ɑ-GTF-pla基因的克隆39-44
• 2.2.4 ɑ-GTF-pla的表達(dá)表達(dá)驗(yàn)證44-53
• 2.2.4.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建44-47
• 2.2.4.2 重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化E.coli DH5α47
• 2.2.4.3 重組表達(dá)載體的篩選與鑒定47-48
• 2.2.4.4 重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化 BL2148
• 2.2.4.5 重組大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)48
• 2.2.4.6 誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析48-49
• 2.2.4.7 α-GTF酶活檢測(cè)49-50
• 2.2.4.8 重組蛋白含量的測(cè)定50
• 2.2.4.9 誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的純化50
• 2.2.4.10 包涵體復(fù)性50-51
• 2.2.4.11 α-GTF-pla的表達(dá)條件優(yōu)化51-52
• 2.2.4.12 α-GTF-pla在乳酸乳球菌中的表達(dá)52-53
• 2.2.5 α-GTF-cas的克隆與表達(dá)驗(yàn)證53-54
• 2.2.6 α-GTF-bre的克隆與表達(dá)驗(yàn)證54
• 2.2.7 FFase-pla的克隆及表達(dá)驗(yàn)證54-55
• 2.2.8 RHL的克隆與表達(dá)驗(yàn)證55
• 2.2.9 metA的克隆與表達(dá)驗(yàn)證55
• 2.2.10 SPase在大腸桿菌中的表達(dá)驗(yàn)證55-57
• 2.2.11 SPase合成功能性低聚糖研究57-59
• 3 結(jié)果與分析59-101
• 3.1 功能基因的挖掘59-61
• 3.1.1 全基因組測(cè)序挖掘功能基因59-61
• 3.1.2 數(shù)據(jù)庫(kù)中 α-GTF的挖掘61
• 3.2 引物設(shè)計(jì)61-62
• 3.3 α-gtf-pla基因的克隆62-68
• 3.3.1 植物乳桿菌基因組DNA的提取62
• 3.3.2 α-GTF-pla的PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物檢測(cè)62-63
• 3.3.3 α-gtf-pla基因PCR產(chǎn)物的回收63
• 3.3.4 植物乳桿菌 α-gtf-pla基因PCR產(chǎn)物測(cè)序63-64
• 3.3.5 克隆載體 α-gtf-pla/pMD-18T構(gòu)建與鑒定64
• 3.3.6 α-gtf-pla完整序列的生物信息學(xué)分析64-68
• 3.4 α-gtf-pla基因的表達(dá)驗(yàn)證68-73
• 3.4.1 α-GTF-pla基因表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定68-69
• 3.4.2 α-GTF-pla基因的表達(dá)與分析69
• 3.4.3 α-GTF-pla包涵體的復(fù)性69-70
• 3.4.4 α-GTF-pla表達(dá)條件的優(yōu)化70-71
• 3.4.5 α-GTF-pla在乳酸乳球中的表達(dá)驗(yàn)證71-73
• 3.5 α-gtf-cas基因的克隆與表達(dá)驗(yàn)證73-77
• 3.5.1 干酪乳桿菌 α-GTF基因的克隆73-74
• 3.5.2 表達(dá)載體 α-gtf-cas/pET-32a的構(gòu)建74-75
• 3.5.3 α-gtf-cas基因在大腸桿菌中的表達(dá)75-76
• 3.5.4 表達(dá)載體 α-gtf-cas/pBM02的構(gòu)建76-77
• 3.6 α-gtf-bre基因的克隆與表達(dá)驗(yàn)證77-79
• 3.6.1 α-gtf-bre基因的克隆77-78
• 3.6.2 表達(dá)載體 α-gtf-bre/pET-32a的構(gòu)建78
• 3.6.3 α-gtf-bre基因在大腸桿菌中的表達(dá)驗(yàn)證78-79
• 3.7 三株乳酸菌中 α-gtf基因的比較分析79-80
• 3.8 FFase基因的克隆與表達(dá)驗(yàn)證80-83
• 3.8.1 FFase基因的克隆80-81
• 3.8.2 表達(dá)載體FFase/pET-32a的構(gòu)建81-82
• 3.8.3 FFase基因在大腸桿菌中的表達(dá)驗(yàn)證82-83
• 3.9 RHL基因的克隆與表達(dá)驗(yàn)證83-85
• 3.9.1 RHL基因的克隆83-84
• 3.9.2 表達(dá)載體RHL/pET-32a的構(gòu)建84
• 3.9.3 RHL基因在大腸桿菌中的表達(dá)驗(yàn)證84-85
• 3.10 MetA基因的克隆與表達(dá)驗(yàn)證85-87
• 3.10.1 MetA基因的克隆85-86
• 3.10.2 MetA基因表達(dá)載體MetA/pET-32a的構(gòu)建86
• 3.10.3 MetA基因在大腸桿菌中的表達(dá)驗(yàn)證86-87
• 3.11 SPase基因的克隆與表達(dá)驗(yàn)證87-90
• 3.11.1 SPase基因的克隆87-88
• 3.11.2 表達(dá)載體SPase/pET-32a的構(gòu)建88-89
• 3.11.3 SPase基因在大腸桿菌中的表達(dá)驗(yàn)證89
• 3.11.4 SPase的純化分析89-90
• 3.11.5 SPase酶活測(cè)定90
• 3.12 SPase酶學(xué)性質(zhì)研究90-94
• 3.12.1 SPase最適反應(yīng)溫度90-91
• 3.12.2 酶的最適反應(yīng)pH91
• 3.12.3 金屬離子對(duì)SPase酶活的影響91-92
• 3.12.4 溫度對(duì)SPase穩(wěn)定性的影響92-93
• 3.12.5 pH對(duì)SPase穩(wěn)定性的影響93
• 3.12.6 SPase酶反應(yīng)常數(shù)測(cè)定93-94
• 3.13 SPase合成功能性低聚糖94-101
• 3.13.1 SPase合成功能性低聚糖底物的篩選94-95
• 3.13.2 蜜二糖合成條件的影響95-98
• 3.13.3 正交分析98-101
• 4 討論與結(jié)論101-108
• 4.1 討論101-107
• 4.1.1 基因挖掘與驗(yàn)證101-102
• 4.1.2 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中包涵體的形成102-104
• 4.1.3 乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)104-106
• 4.1.4 SPase合成功能性低聚糖106-107
• 4.2 結(jié)論107-108
• 致謝108-109
• 參考文獻(xiàn)109-121
• 附錄121

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：820188