本文關鍵詞：家蠶BmJun與BmNep1基因的功能研究

  更多相關文章： 家蠶 JNK信號途徑 核仁關鍵蛋白1基因 基因功能 生殖發(fā)育 核糖體生物發(fā)生

【摘要】：c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號途徑在細胞增殖、轉化、分化和凋亡等發(fā)育過程中起著重要作用。核仁關鍵蛋白1(Nep1)基因是酵母核糖體40S小亞基生物發(fā)生所必需,人類Nep1基因的突變會引發(fā)神經退行性疾病。家蠶是重要的經濟昆蟲也是鱗翅目的核心模式昆蟲,家蠶中Jun和Nep1基因的報道幾乎空白。本研究室前期克隆了家蠶BmJun、BmFos和BmNep1基因,但其生物學功能仍有許多不明之處。本文運用RT-PCR、qRT-PCR、IP、Western blotting、免疫組織化學和LC-MS/MS等技術手段,研究了家蠶JNK途徑中BmJun蛋白與BmFos蛋白的關系及其對家蠶生殖發(fā)育的調控功能;研究了BmNep1蛋白在家蠶幼蟲蛻皮與化蛹變態(tài)過程中受蛻皮激素誘導在細胞核內的表達調控,探討了其參與核糖體生物發(fā)生的過程及其組織共通性。主要結果如下:1家蠶JNK途徑通過調控BmVg的合成和貯存影響生殖發(fā)育c-Jun蛋白在哺乳動物中既可以形成同源二聚體,也可與Fos蛋白形成異源二聚體AP-1,發(fā)揮轉錄因子的調控作用。果蠅的DJun和DFos蛋白只形成異源二聚體。本文根據前期克隆的BmJun與BmFos基因序列,構建了pCMV-BmJun-EGFP和pCMV-BmFos-FLAG重組質粒,異源表達于HEK293T細胞系中,提取總蛋白進行了IP實驗,結果表明,BmJun與BmFos蛋白存在相互作用,推測其形成BmAP-1發(fā)揮調控作用。本實驗室前期干涉BmJun出現(xiàn)了子代卵發(fā)育不良的結果�；诩倚Q卵黃蛋白原(BmVg)在幼蟲化蛹變態(tài)期間的脂肪體中合成的生理基礎,本文調查了該時期BmJun,BmFos與BmVg基因的表達模式。在脂肪體組織中,BmVg基因的表達模式與BmJun/BmFos基因一致,在預蛹期顯著上調表達,進一步調查證實BmJun蛋白水平在預蛹期脂肪體中顯著升高。BmJun基因及蛋白在卵巢中的表達變化趨勢與脂肪體中變化一致。搖擺期干涉BmJun基因,BmVg基因的表達量顯著下調。在搖擺期用JNK激酶的抑制劑SP600125處理家蠶,處理組雌性家蠶的BmVg蛋白在脂肪體和卵巢組織中表達量降低,蛹期的卵巢生殖腺系數顯著降低,產出發(fā)育不良卵及異常產卵的成蟲的比例增加,并存在劑量效應。表明BmJun/BmFos可能以二聚體BmAP-1參與調控家蠶BmVg基因在脂肪體組織中的合成,并最終參與卵巢與蠶卵的發(fā)育調控。2家蠶BmNep1蛋白受蛻皮激素調控參與核糖體的生物發(fā)生Nep1蛋白參與酵母40S核糖體的生物發(fā)生,鼠同系物Nep1可恢復酵母Nep1突變引發(fā)的功能缺陷,人類Nep1突變引發(fā)BCS疾病。昆蟲中尚無Nep1與核糖體生物發(fā)生相關的功能研究報道。我們前期已在絲腺退化過程中發(fā)現(xiàn)BmNep1基因與蛻皮激素初級響應基因BmE74A的上調表達趨勢一致,并用20E誘導BmN細胞系中BmNep1的表達。本文調查了BmNep1基因與蛋白在家蠶5齡第3天各組織中的表達譜,發(fā)現(xiàn)其在絲腺組織中特異性高表達,進一步調查4齡幼蟲蛻皮期間與幼蟲化蛹變態(tài)期間絲腺中BmNep1蛋白的表達,其隨蛻皮激素的滴度增加而上調。在BmNep1被上調表達的5L3至預蛹期期間,免疫沉淀與BmNep1相互作用的蛋白,LC-MS/MS結果表明,幾乎所有鑒定的蛋白與核糖體生物發(fā)生相關。進一步在卵巢組織中調查結果顯示,BmNep1基因與蛋白均受蛻皮激素誘導表達。表明蛻皮激素對BmNep1蛋白的調控是非組織特異性的,BmNep1蛋白可能參與核糖體的生物發(fā)生。
【關鍵詞】：家蠶 JNK信號途徑 核仁關鍵蛋白1基因 基因功能 生殖發(fā)育 核糖體生物發(fā)生
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 序言12-30
• 1 JNK信號途徑及其在家蠶中的相關研究12-22
• 1.1 JNK信號途徑14-17
• 1.2 JNK信號通路主要成員Jun-Fos/AP-117-19
• 1.3 家蠶Jun-Fos/AP-1 的研究基礎與意義19-22
• 2 核糖體必需蛋白 122-28
• 2.1 核糖體的生物發(fā)生與核糖體必需蛋白22-24
• 2.2 核糖體必需蛋白1基因的功能及其研究進展24-25
• 2.3 家蠶絲腺細胞核糖體發(fā)生與絲蛋白質高效合成25-26
• 2.4 家蠶Nep1的研究基礎26-28
• 3 研究目的與意義28
• 4 研究思路28-30
• 第二章 家蠶中JNK途徑通過調控VG合成影響生殖30-55
• 1 引言30
• 2 實驗材料與方法30-42
• 2.1 實驗動物30-31
• 2.2 實驗用細胞31-32
• 2.3 常用溶液32-33
• 2.4 常用實驗方法33-42
• 3 實驗結果42-53
• 3.1 BmJun蛋白在家蠶絲腺中的組織定位42-44
• 3.2 家蠶BmJun蛋白與BmFos蛋白相互作用44-46
• 3.3 家蠶脂肪體中BmJun與BmFos在幼蟲化蛹的變態(tài)期間的表達模式46-47
• 3.4 干擾BmJun基因后，BmVg基因在家蠶脂肪體中的表達變化47-48
• 3.5 家蠶卵巢中BmJun基因及其蛋白在幼蟲化蛹變態(tài)過程中同步上調表達48-49
• 3.6 抑制c-Jun氨基末端激酶（JNK）對于子代卵發(fā)育的影響49-52
• 3.7 抑制JNK對家蠶卵黃蛋白原蛋白在脂肪體與卵巢中表達的影響52-53
• 4 討論53-55
• 第三章 家蠶中BmNep1基因的研究55-68
• 1 引言55-56
• 2 材料與方法56-58
• 2.1 實驗動物與細胞56
• 2.2 實時定量PCR（qRT-PCR）56
• 2.3 多克隆抗體的制備56
• 2.4 免疫組織熒光56
• 2.5 蛋白銀染方法56-57
• 2.6 IP與Western blotting57
• 2.7 LC-MS/MS57-58
• 3 結果與分析58-66
• 3.1 家蠶BmNep1的組織表達58-60
• 3.2 BmNep1蛋白在家蠶蛻皮與變態(tài)過程中絲腺中的表達變化60-61
• 3.3 家蠶中BmNep1與核核糖體生物發(fā)生相關61-65
• 3.4 BmNep1基因及蛋白在幼蟲化蛹變態(tài)期間卵巢中的表達變化65-66
• 4 討論66-68
• 第四章 綜合結論和創(chuàng)新點68-71
• 1 綜合結論68-70
• 1.1 家蠶JNK途徑中主要轉錄因子BmJun與BmFos蛋白存在相互作用68
• 1.2 家蠶JNK途徑中，，BmJun-BmFos/AP-1 通過調控BmVg蛋白的合成調控生殖發(fā)育68-69
• 1.3 家蠶中BmNep1蛋白受內源性蛻皮激素調控參與核糖體的生物發(fā)生69-70
• 2 主要創(chuàng)新點70-71
• 參考文獻71-82
• 研究生期間參與項目及成果82-84
• 附錄84-88
• 附錄1 文中主要所用縮略詞一覽表84-86
• 附錄2 本文使用的主要生化試劑86-87
• 附錄3 本文使用的主要儀器設備87-88
• 致謝88-89

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