本文關(guān)鍵詞：家蠶BmJun與BmNep1基因的功能研究

  更多相關(guān)文章： 家蠶 JNK信號(hào)途徑 核仁關(guān)鍵蛋白1基因 基因功能 生殖發(fā)育 核糖體生物發(fā)生

【摘要】：c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號(hào)途徑在細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化、分化和凋亡等發(fā)育過(guò)程中起著重要作用。核仁關(guān)鍵蛋白1(Nep1)基因是酵母核糖體40S小亞基生物發(fā)生所必需,人類Nep1基因的突變會(huì)引發(fā)神經(jīng)退行性疾病。家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲也是鱗翅目的核心模式昆蟲,家蠶中Jun和Nep1基因的報(bào)道幾乎空白。本研究室前期克隆了家蠶BmJun、BmFos和BmNep1基因,但其生物學(xué)功能仍有許多不明之處。本文運(yùn)用RT-PCR、qRT-PCR、IP、Western blotting、免疫組織化學(xué)和LC-MS/MS等技術(shù)手段,研究了家蠶JNK途徑中BmJun蛋白與BmFos蛋白的關(guān)系及其對(duì)家蠶生殖發(fā)育的調(diào)控功能;研究了BmNep1蛋白在家蠶幼蟲蛻皮與化蛹變態(tài)過(guò)程中受蛻皮激素誘導(dǎo)在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)調(diào)控,探討了其參與核糖體生物發(fā)生的過(guò)程及其組織共通性。主要結(jié)果如下:1家蠶JNK途徑通過(guò)調(diào)控BmVg的合成和貯存影響生殖發(fā)育c-Jun蛋白在哺乳動(dòng)物中既可以形成同源二聚體,也可與Fos蛋白形成異源二聚體AP-1,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用。果蠅的DJun和DFos蛋白只形成異源二聚體。本文根據(jù)前期克隆的BmJun與BmFos基因序列,構(gòu)建了pCMV-BmJun-EGFP和pCMV-BmFos-FLAG重組質(zhì)粒,異源表達(dá)于HEK293T細(xì)胞系中,提取總蛋白進(jìn)行了IP實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,BmJun與BmFos蛋白存在相互作用,推測(cè)其形成BmAP-1發(fā)揮調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)室前期干涉BmJun出現(xiàn)了子代卵發(fā)育不良的結(jié)果�；诩倚Q卵黃蛋白原(BmVg)在幼蟲化蛹變態(tài)期間的脂肪體中合成的生理基礎(chǔ),本文調(diào)查了該時(shí)期BmJun,BmFos與BmVg基因的表達(dá)模式。在脂肪體組織中,BmVg基因的表達(dá)模式與BmJun/BmFos基因一致,在預(yù)蛹期顯著上調(diào)表達(dá),進(jìn)一步調(diào)查證實(shí)BmJun蛋白水平在預(yù)蛹期脂肪體中顯著升高。BmJun基因及蛋白在卵巢中的表達(dá)變化趨勢(shì)與脂肪體中變化一致。搖擺期干涉BmJun基因,BmVg基因的表達(dá)量顯著下調(diào)。在搖擺期用JNK激酶的抑制劑SP600125處理家蠶,處理組雌性家蠶的BmVg蛋白在脂肪體和卵巢組織中表達(dá)量降低,蛹期的卵巢生殖腺系數(shù)顯著降低,產(chǎn)出發(fā)育不良卵及異常產(chǎn)卵的成蟲的比例增加,并存在劑量效應(yīng)。表明BmJun/BmFos可能以二聚體BmAP-1參與調(diào)控家蠶BmVg基因在脂肪體組織中的合成,并最終參與卵巢與蠶卵的發(fā)育調(diào)控。2家蠶BmNep1蛋白受蛻皮激素調(diào)控參與核糖體的生物發(fā)生Nep1蛋白參與酵母40S核糖體的生物發(fā)生,鼠同系物Nep1可恢復(fù)酵母Nep1突變引發(fā)的功能缺陷,人類Nep1突變引發(fā)BCS疾病。昆蟲中尚無(wú)Nep1與核糖體生物發(fā)生相關(guān)的功能研究報(bào)道。我們前期已在絲腺退化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)BmNep1基因與蛻皮激素初級(jí)響應(yīng)基因BmE74A的上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)一致,并用20E誘導(dǎo)BmN細(xì)胞系中BmNep1的表達(dá)。本文調(diào)查了BmNep1基因與蛋白在家蠶5齡第3天各組織中的表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)其在絲腺組織中特異性高表達(dá),進(jìn)一步調(diào)查4齡幼蟲蛻皮期間與幼蟲化蛹變態(tài)期間絲腺中BmNep1蛋白的表達(dá),其隨蛻皮激素的滴度增加而上調(diào)。在BmNep1被上調(diào)表達(dá)的5L3至預(yù)蛹期期間,免疫沉淀與BmNep1相互作用的蛋白,LC-MS/MS結(jié)果表明,幾乎所有鑒定的蛋白與核糖體生物發(fā)生相關(guān)。進(jìn)一步在卵巢組織中調(diào)查結(jié)果顯示,BmNep1基因與蛋白均受蛻皮激素誘導(dǎo)表達(dá)。表明蛻皮激素對(duì)BmNep1蛋白的調(diào)控是非組織特異性的,BmNep1蛋白可能參與核糖體的生物發(fā)生。
【關(guān)鍵詞】：家蠶 JNK信號(hào)途徑 核仁關(guān)鍵蛋白1基因 基因功能 生殖發(fā)育 核糖體生物發(fā)生
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 序言12-30
• 1 JNK信號(hào)途徑及其在家蠶中的相關(guān)研究12-22
• 1.1 JNK信號(hào)途徑14-17
• 1.2 JNK信號(hào)通路主要成員Jun-Fos/AP-117-19
• 1.3 家蠶Jun-Fos/AP-1 的研究基礎(chǔ)與意義19-22
• 2 核糖體必需蛋白 122-28
• 2.1 核糖體的生物發(fā)生與核糖體必需蛋白22-24
• 2.2 核糖體必需蛋白1基因的功能及其研究進(jìn)展24-25
• 2.3 家蠶絲腺細(xì)胞核糖體發(fā)生與絲蛋白質(zhì)高效合成25-26
• 2.4 家蠶Nep1的研究基礎(chǔ)26-28
• 3 研究目的與意義28
• 4 研究思路28-30
• 第二章 家蠶中JNK途徑通過(guò)調(diào)控VG合成影響生殖30-55
• 1 引言30
• 2 實(shí)驗(yàn)材料與方法30-42
• 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物30-31
• 2.2 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞31-32
• 2.3 常用溶液32-33
• 2.4 常用實(shí)驗(yàn)方法33-42
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果42-53
• 3.1 BmJun蛋白在家蠶絲腺中的組織定位42-44
• 3.2 家蠶BmJun蛋白與BmFos蛋白相互作用44-46
• 3.3 家蠶脂肪體中BmJun與BmFos在幼蟲化蛹的變態(tài)期間的表達(dá)模式46-47
• 3.4 干擾BmJun基因后，BmVg基因在家蠶脂肪體中的表達(dá)變化47-48
• 3.5 家蠶卵巢中BmJun基因及其蛋白在幼蟲化蛹變態(tài)過(guò)程中同步上調(diào)表達(dá)48-49
• 3.6 抑制c-Jun氨基末端激酶（JNK）對(duì)于子代卵發(fā)育的影響49-52
• 3.7 抑制JNK對(duì)家蠶卵黃蛋白原蛋白在脂肪體與卵巢中表達(dá)的影響52-53
• 4 討論53-55
• 第三章 家蠶中BmNep1基因的研究55-68
• 1 引言55-56
• 2 材料與方法56-58
• 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞56
• 2.2 實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）56
• 2.3 多克隆抗體的制備56
• 2.4 免疫組織熒光56
• 2.5 蛋白銀染方法56-57
• 2.6 IP與Western blotting57
• 2.7 LC-MS/MS57-58
• 3 結(jié)果與分析58-66
• 3.1 家蠶BmNep1的組織表達(dá)58-60
• 3.2 BmNep1蛋白在家蠶蛻皮與變態(tài)過(guò)程中絲腺中的表達(dá)變化60-61
• 3.3 家蠶中BmNep1與核核糖體生物發(fā)生相關(guān)61-65
• 3.4 BmNep1基因及蛋白在幼蟲化蛹變態(tài)期間卵巢中的表達(dá)變化65-66
• 4 討論66-68
• 第四章 綜合結(jié)論和創(chuàng)新點(diǎn)68-71
• 1 綜合結(jié)論68-70
• 1.1 家蠶JNK途徑中主要轉(zhuǎn)錄因子BmJun與BmFos蛋白存在相互作用68
• 1.2 家蠶JNK途徑中，，BmJun-BmFos/AP-1 通過(guò)調(diào)控BmVg蛋白的合成調(diào)控生殖發(fā)育68-69
• 1.3 家蠶中BmNep1蛋白受內(nèi)源性蛻皮激素調(diào)控參與核糖體的生物發(fā)生69-70
• 2 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)70-71
• 參考文獻(xiàn)71-82
• 研究生期間參與項(xiàng)目及成果82-84
• 附錄84-88
• 附錄1 文中主要所用縮略詞一覽表84-86
• 附錄2 本文使用的主要生化試劑86-87
• 附錄3 本文使用的主要儀器設(shè)備87-88
• 致謝88-89

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本文編號(hào)：813585