發(fā)布時(shí)間：2017-09-08 07:14

  本文關(guān)鍵詞：水稻基因AL2調(diào)控葉綠體內(nèi)含子剪接的分子機(jī)理研究

  更多相關(guān)文章： 水稻 白化苗 葉綠體發(fā)育 內(nèi)含子剪接因子 CRS1

【摘要】：葉綠體通過光合作用合成植物激素和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物,對(duì)植物正常的生長和發(fā)育過程起著重要的作用。葉綠體的形態(tài)結(jié)構(gòu)、葉綠素的含量與植物的光合作用及其生長發(fā)育密切相關(guān)。葉綠體發(fā)育的缺陷通常會(huì)導(dǎo)致植物葉色的變異,因而葉色突變體是研究植物葉綠體發(fā)育和光合作用的理想材料。盡管一些參與葉綠體分化和發(fā)育的基因或調(diào)控基因已經(jīng)被分離和鑒定,但是葉綠體分化和發(fā)育的分子機(jī)理仍有待于進(jìn)一步研究,新基因的鑒定和功能分析對(duì)于深入了解葉綠體分化和發(fā)育仍十分重要。本實(shí)驗(yàn)室前期通過對(duì)T-DNA插入突變體庫(粳稻中花11背景)進(jìn)行表型篩選,得到了一系列的白化苗突變體,稱之為albino leaf mutants(als)。本實(shí)驗(yàn)室已對(duì)albino leaf 1(al1)進(jìn)行了詳細(xì)的鑒定和分析。因此,本研究著重對(duì)突變體albino leaf 2(al2)開展相關(guān)的研究。獲得了以下結(jié)果:1、表型分析表明,突變體al2在萌發(fā)出芽后即表現(xiàn)出明顯的白化表型,整個(gè)植株全白,生長至三葉期幼苗死亡;葉綠素含量測(cè)定結(jié)果表明,突變體al2的葉綠素含量幾乎為零,顯著低于野生型中花11(ZH11)。2、透射電鏡觀察結(jié)果表明,在早期的發(fā)育階段,突變體al2葉片的葉綠體結(jié)構(gòu)即存在著嚴(yán)重的缺陷,無法形成完整的類囊體結(jié)構(gòu),最終導(dǎo)致葉綠體整體的降解。3、實(shí)驗(yàn)室前期工作已證實(shí)T-DNA插入基因Loc_Os09g19850的第9個(gè)外顯子導(dǎo)致了突變體al2出現(xiàn)白化表型。RT-PCR的結(jié)果表明,由于T-DNA的插入導(dǎo)致了基因Loc_Os09g19850不表達(dá),初步證實(shí)了al2的突變表型受Loc_Os09g19850基因所控制,即Loc_Os09g19850就是水稻基因AL2(Albino Leaf 2)的候選基因。水稻基因AL2具有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子,編碼了一個(gè)葉綠體內(nèi)IIA型內(nèi)含子剪接因子CRS1(chloroplast group IIA intron splicing facilitator)。4、功能驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)Loc_Os09g19850就是水稻基因AL2。獲得5個(gè)獨(dú)立的Loc_Os09g19850互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因株系,經(jīng)表型觀察、葉綠素含量測(cè)定和qRT-PCR等證實(shí)基因Loc_Os09g19850的表達(dá)可恢復(fù)突變體al2的表型;獲得了6個(gè)獨(dú)立的Loc_Os09g19850反義轉(zhuǎn)基因株系,經(jīng)表型觀察和qRT-PCR等證實(shí)基因Loc_Os09g19850的功能喪失可重現(xiàn)突變體al2的表型。5、AL2啟動(dòng)子與GUS基因融合表達(dá)的結(jié)果表明,AL2從種子萌動(dòng)起就開始表達(dá),一直到成熟期;幼苗階段除在幼葉等綠色組織表達(dá)外,也在胚根鞘和根毛等非綠色組織表達(dá);在成熟葉中表達(dá)最強(qiáng),在穗、穎花、莖和葉鞘等均表達(dá);組織切片顯示,AL2在莖的內(nèi)皮層也表達(dá)。qRT-PCR的結(jié)果也表明AL2在根、莖、葉、幼穗和成熟穗中均表達(dá),其中在葉中表達(dá)最強(qiáng)。另外,亞細(xì)胞定位結(jié)果表明AL2蛋白定位于葉綠體。6、已有的報(bào)道證實(shí)CRS1在擬南芥和玉米中調(diào)控了葉綠體atpF基因的IIA型內(nèi)含子的剪切。本研究發(fā)現(xiàn),atpF基因在突變體al2中的表達(dá)顯著低于其在野生型的表達(dá),暗示AL2基因在水稻中亦編碼了一個(gè)有功能的CRS1。同時(shí),對(duì)葉綠體內(nèi)含有IIB型內(nèi)含子的ndhA、ndhB、petD和ycf3等基因和含有I型內(nèi)含子的trnL基因的qRT-PCR結(jié)果表明,AL2極有可能參與了水稻葉綠體內(nèi)含有IIB型和I型內(nèi)含子的基因的剪接調(diào)控。7、對(duì)突變體al2中葉綠體相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行了qRT-PCR分析,結(jié)果表明:AL2基因的功能喪失顯著下調(diào)了OsHAP3A、OsHAP3B、OsHAP3C、OsPPR1、YGL1、Cab1R、Cab、HemA和Cao等葉綠素生物合成相關(guān)基因(chlorophyll biosynthetic genes,CBGs)以及psbO、psaD、psaE、psbP、lhcb2和rbcS等核編碼的葉綠體基因(nuclear-encoded chloroplast genes,NECGs)的表達(dá);同時(shí)還下調(diào)了psaA和psbA兩個(gè)質(zhì)體編碼的多聚酶(plastid-encoded polymerase,PEP)的表達(dá),但對(duì)psaB和rps14兩個(gè)PEP以及atpA、petA、rpoB和rps2等核編碼的多聚酶(nucleus-encoded polymerase,NEP)的表達(dá)無作用。因此,AL2是通過協(xié)同部分葉綠體相關(guān)基因的表達(dá)來調(diào)控水稻葉綠體發(fā)育。總之,本研究鑒定了一個(gè)與水稻葉綠體發(fā)育相關(guān)的基因AL2,該基因的功能喪失導(dǎo)致了突變體al2的白化表型;分子克隆和功能分析證實(shí)Loc_Os09g19850就是水稻基因AL2,它編碼了一個(gè)葉綠體內(nèi)IIA型內(nèi)含子剪接因子CRS1;qRT-PCR結(jié)果表明AL2極有可能參與了水稻葉綠體內(nèi)含有IIB型和I型內(nèi)含子的基因的剪接調(diào)控,并且是通過協(xié)同部分葉綠體相關(guān)基因的表達(dá)來調(diào)控水稻葉綠體發(fā)育。本研究為進(jìn)一步研究水稻CRS1基因調(diào)控葉綠體發(fā)育的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：水稻 白化苗 葉綠體發(fā)育 內(nèi)含子剪接因子 CRS1
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S511
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 英文縮略詞與符號(hào)表8-12
• 1 文獻(xiàn)綜述12-22
• 1.1 葉色突變體的來源13
• 1.2 葉色突變體的表型與葉綠素含量的關(guān)系13-14
• 1.3 葉色突變體的表型與葉綠體的結(jié)構(gòu)14
• 1.4 葉色變異的遺傳方式14-15
• 1.5 葉色突變的分子機(jī)制15-17
• 1.5.1 葉綠素生物合成途徑受阻15
• 1.5.2 葉綠素降解途徑受阻15-16
• 1.5.3 葉綠體的分化和發(fā)育受阻16
• 1.5.4 質(zhì)核信號(hào)傳導(dǎo)途徑受阻16-17
• 1.5.5 葉綠體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)受阻17
• 1.6 葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)與表達(dá)調(diào)控17-21
• 1.6.1 葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)17-18
• 1.6.2 葉綠體基因的轉(zhuǎn)錄18-19
• 1.6.3 葉綠體基因的轉(zhuǎn)錄后加工19-21
• 1.6.3.1 RNA加工19
• 1.6.3.2 RNA編輯19
• 1.6.3.3 RNA剪接19-21
• 1.7 本研究的目的和意義21-22
• 2 材料與方法22-39
• 2.1 供試植物材料22-23
• 2.2 材料種植23
• 2.3 主要試劑23
• 2.4 主要儀器設(shè)備23-24
• 2.5 葉綠素含量的測(cè)定24
• 2.6 透射電子顯微鏡觀察樣品的制作24-25
• 2.7 GUS活性組織化學(xué)染色25
• 2.8 引物的設(shè)計(jì)與合成25-30
• 2.8.1 AL2基因的RT-PCR引物26
• 2.8.2 AL2基因的qRT-PCR引物26-27
• 2.8.3 葉綠體內(nèi)含有I型和II型內(nèi)含子基因的qRT-PCR引物27
• 2.8.4 水稻CBGs的qRT-PCR引物27-28
• 2.8.5 水稻PEP的qRT-PCR引物28-29
• 2.8.6 水稻NEP的qRT-PCR引物29-30
• 2.8.7 水稻NECGs的q RT-PCR引物30
• 2.9 水稻總DNA的提取30-31
• 2.10 水稻原生質(zhì)體GFP蛋白的瞬時(shí)表達(dá)31-36
• 2.10.1 引物設(shè)計(jì)31-32
• 2.10.2 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化32
• 2.10.3 雙酶切32-33
• 2.10.4 連接33
• 2.10.5 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌33
• 2.10.6 轉(zhuǎn)化子的鑒定33-34
• 2.10.7 質(zhì)粒DNA的制備和純化34
• 2.10.8 水稻原生質(zhì)體的游離34-35
• 2.10.9 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體35
• 2.10.10 蛋白的亞細(xì)胞定位及觀察35-36
• 2.11 水稻總RNA的提取36
• 2.12 反轉(zhuǎn)錄第一鏈的合成36-37
• 2.13 內(nèi)參基因actin的檢測(cè)37
• 2.14 基因表達(dá)的RT-PCR分析37-38
• 2.14.1 PCR反應(yīng)37
• 2.14.2 電泳及凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)37-38
• 2.15 基因表達(dá)的qRT-PCR分析38
• 2.15.1 qRT-PCR反應(yīng)38
• 2.15.2 基因表達(dá)的相對(duì)定量38
• 2.16 進(jìn)化樹的構(gòu)建38-39
• 3 結(jié)果39-54
• 3.1 葉色突變體al2的表型39-40
• 3.2 葉色突變體al2的葉綠體超微結(jié)構(gòu)40-41
• 3.3 水稻基因AL2候選基因的分析41-42
• 3.4 水稻基因AL2的功能驗(yàn)證42-45
• 3.4.1 水稻基因AL2的功能互補(bǔ)42-44
• 3.4.2 水稻基因AL2的敲除44-45
• 3.5 水稻基因AL2的表達(dá)模式45-49
• 3.5.1 水稻基因AL2的啟動(dòng)子與GUS的融合表達(dá)45-46
• 3.5.2 水稻基因AL2在不同組織器官的表達(dá)量46-47
• 3.5.3 水稻AL2-GFP融合蛋白的亞細(xì)胞定位47-49
• 3.6 水稻AL2基因參與葉綠體基因內(nèi)含子的剪接49-52
• 3.6.1 水稻AL2同源蛋白的進(jìn)化關(guān)系49-51
• 3.6.2 突變體al2中含有葉綠體I型和II型內(nèi)含子基因的表達(dá)51-52
• 3.7 葉綠體相關(guān)基因的表達(dá)52-54
• 4 討論與結(jié)論54-57
• 4.1 討論54-55
• 4.1.1 AL2可能參與葉綠體基因I型、IIA型和IIB型內(nèi)含子的剪接54-55
• 4.1.2 AL2是協(xié)同部分葉綠體相關(guān)基因的表達(dá)來調(diào)控葉綠體發(fā)育的55
• 4.2 結(jié)論55-57
• 致謝57-58
• 參考文獻(xiàn)58-69
• 附錄A 相關(guān)載體構(gòu)建所用引物69-70
• 附錄B 水稻木村B水培營養(yǎng)液（1000×）70-71
• 附錄C 水稻AL2蛋白序列（948AA）71

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：812616