本文關(guān)鍵詞：耐輻射奇球菌反應(yīng)調(diào)節(jié)基因突變體drRRA的蛋白質(zhì)組學(xué)研究及其基因編輯系統(tǒng)的探索

  更多相關(guān)文章： 耐輻射奇球菌 反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白 蛋白質(zhì)組學(xué) 基因編輯

【摘要】：耐輻射奇球菌是迄今為止地球上發(fā)現(xiàn)的最耐輻射的生物之一,是研究脅迫環(huán)境下細(xì)胞如何維持基因組完整性和穩(wěn)定性的模式生物。耐輻射奇球菌對(duì)于電離輻射,過氧化氫和干燥等脅迫具有極強(qiáng)的抗性。研究表明其強(qiáng)大的生存能力很大程度緣自細(xì)胞對(duì)于氧化壓力強(qiáng)大的抵抗能力,其普遍存在的雙組份系統(tǒng)在這之中扮演了不可或缺的角色。前期研究表明DrRRA蛋白是耐輻射奇球菌雙組分系統(tǒng)中一個(gè)重要的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該蛋白的缺失將導(dǎo)致包括DNA損傷響應(yīng)、修復(fù)和復(fù)制相關(guān)基因表達(dá)的改變。該基因的完全敲除將導(dǎo)致耐輻射奇球菌細(xì)胞對(duì)于電離輻射、氧化壓力等脅迫的抗性降低,表明其很有可能通過特異性的結(jié)合到下游相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域參與了細(xì)胞的抗氧化途徑。為了進(jìn)一步闡明DrRRA蛋白在細(xì)胞內(nèi)的功能,我們利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法比較了野生型耐輻射奇球菌和drRRA缺失菌株在脅迫和非脅迫環(huán)境下蛋白質(zhì)的表達(dá)水平,主要結(jié)論如下：1.蛋白質(zhì)組學(xué)比較分析發(fā)現(xiàn)野生型耐輻射奇球菌和drRRA缺失菌株在電離輻射脅迫和非脅迫環(huán)境中具有相似的蛋白質(zhì)組表達(dá)變化,其中52個(gè)蛋白的表達(dá)差異在1.5倍以上,包含了31個(gè)表達(dá)下調(diào)的蛋白和21個(gè)表達(dá)上調(diào)的蛋白,表明DrRRA在蛋白質(zhì)翻譯水平上參與了耐輻射奇球菌細(xì)胞對(duì)于電離輻射脅迫的響應(yīng)過程。2.這些表達(dá)差異蛋白可以分為以下三類：脅迫響應(yīng)蛋白(7個(gè)),代謝調(diào)控蛋白(16個(gè))以及功能未知的蛋白(20個(gè))。3.根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果,敲除了三個(gè)具有代表性的基因：dra0259(編碼過氧化氫酶E),dr1146(編碼功能未知蛋白),以及dr1538(編碼高滲透誘導(dǎo)蛋白C)。這些基因的缺失大大降低了耐輻射奇球菌對(duì)于氧化壓力的抗性,驗(yàn)證了蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果。4.由于有相當(dāng)一部分的基因在數(shù)據(jù)庫(kù)中并沒有注釋,我們嘗試在耐輻射奇球菌中構(gòu)建、導(dǎo)入一套基于CRISPR技術(shù)的基因編輯技術(shù),進(jìn)而闡明這些基因在細(xì)胞內(nèi)的功能。初步實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明Cas9蛋白及其所需的向?qū)NA能夠在耐輻射奇球菌中表達(dá)。然而,這套系統(tǒng)并未如我們預(yù)期般的對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行敲除,還需要后續(xù)的優(yōu)化。綜上所述,我們比較了野生型耐輻射奇球菌和drRRA缺失菌株在不同環(huán)境下的蛋白質(zhì)組表達(dá)差異,發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了一系列在細(xì)胞內(nèi)參與氧化損傷響應(yīng)的蛋白。結(jié)合前期的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析數(shù)據(jù),我們進(jìn)一步的確認(rèn)了DrRRA參與耐輻射奇球菌對(duì)于不同脅迫的響應(yīng)過程。
【關(guān)鍵詞】：耐輻射奇球菌 反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白 蛋白質(zhì)組學(xué) 基因編輯
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q93;Q78
【目錄】：

• 致謝7-8
• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 主要縮略詞12-16
• 1 引言16-40
• 1.1 耐輻射奇球菌的介紹16-29
• 1.1.1 耐輻射奇球菌的概況16-17
• 1.1.2 耐輻射奇球菌的基因組分析17-18
• 1.1.3 耐輻射奇球菌的極端抗性18-20
• 1.1.4 耐輻射奇球菌的極端抗性機(jī)制20-24
• 1.1.5 耐輻射奇球菌的DNA損傷修復(fù)機(jī)制24-28
• 1.1.6 輻射/干燥響應(yīng)基序(RDRM序列)28-29
• 1.1.7 耐輻射奇球菌的生物學(xué)應(yīng)用29
• 1.2 雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)與DrRRA的研究進(jìn)展29-33
• 1.2.1 雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的簡(jiǎn)介29-30
• 1.2.2 雙組分系統(tǒng)的基本組成和作用機(jī)制30-31
• 1.2.3 反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白的多樣性及功能31-32
• 1.2.4 耐輻射奇球菌中反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白DrRRA的研究進(jìn)展32-33
• 1.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的介紹33-40
• 1.3.1 基因編輯技術(shù)簡(jiǎn)介33-34
• 1.3.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)34-35
• 1.3.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的免疫機(jī)制35-36
• 1.3.4 Ⅱ型CRISPR-Cas9系統(tǒng)36-38
• 1.3.5 CRISPR-Cas9技術(shù)的應(yīng)用38-40
• 2 實(shí)驗(yàn)材料與方法40-57
• 2.1 菌株與質(zhì)粒40-41
• 2.2 主要試劑與儀器41-43
• 2.2.1 主要試劑盒41
• 2.2.2 主要酶試劑41-42
• 2.2.3 主要儀器42-43
• 2.3 雙向電泳實(shí)驗(yàn)方法43-46
• 2.3.1 蛋白提取43
• 2.3.2 蛋白定量43
• 2.3.3 雙向電泳43-44
• 2.3.4 電泳凝膠染色44
• 2.3.5 圖象掃描和分析44-45
• 2.3.6 差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的膠內(nèi)酶解和鑒定45
• 2.3.7 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索45-46
• 2.4 耐輻射奇球菌基因缺失突變株的構(gòu)建及生存率的測(cè)定46-48
• 2.4.1 耐輻射奇球菌基因缺失突變株的構(gòu)建46
• 2.4.2 生存率的測(cè)定46-48
• 2.5 CRISPR-Cas9質(zhì)粒構(gòu)建方法48-50
• 2.5.1 主要PCR引物列表48-49
• 2.5.2 主要反應(yīng)體系49-50
• 2.6 主要實(shí)驗(yàn)方法50-57
• 2.6.1 質(zhì)粒提取步驟50-51
• 2.6.2 基因組提取步驟51-52
• 2.6.3 大腸桿菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化52
• 2.6.4 點(diǎn)突變PCR及產(chǎn)物轉(zhuǎn)化52-53
• 2.6.5 耐輻射奇球菌的感受態(tài)制備及質(zhì)粒/PCR產(chǎn)物等的轉(zhuǎn)化53
• 2.6.6 PCR產(chǎn)物純化53-54
• 2.6.7 膠回收步驟54
• 2.6.8 RNA的提取54-56
• 2.6.9 反轉(zhuǎn)錄體系56
• 2.6.10 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)56
• 2.6.11 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定56-57
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析57-76
• 3.1 耐輻射奇球菌drRRA突變株的蛋白質(zhì)組學(xué)電泳圖譜57-58
• 3.2 drRRA的缺失導(dǎo)致的蛋白質(zhì)表達(dá)差異58-65
• 3.3 表達(dá)差異基因的敲除導(dǎo)致耐輻射奇球菌對(duì)氧化壓力敏感65-67
• 3.4 耐輻射奇球菌中CRISPR-Cas9系統(tǒng)的構(gòu)建67-71
• 3.4.1 帶綠色熒光蛋白eGFP的穿梭質(zhì)粒PRADG的構(gòu)建67
• 3.4.2 融合綠色熒光蛋白標(biāo)簽的Cas9蛋白的表達(dá)質(zhì)粒PRADG-Cas9的構(gòu)建67-68
• 3.4.3 PRAD-Cas9的構(gòu)建68-69
• 3.4.4 連有啟動(dòng)子的gRNA的設(shè)計(jì)69-70
• 3.4.5 PRADG-CRISPR與PRAD-CRISPR質(zhì)粒的構(gòu)建70-71
• 3.5 耐輻射奇球菌中CRISPRi系統(tǒng)的構(gòu)建71
• 3.6 CRISPR-Cas9系統(tǒng)的在耐輻射奇球菌體內(nèi)表達(dá)驗(yàn)證71-73
• 3.6.1 耐輻射奇球菌的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化71
• 3.6.2 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定71-72
• 3.6.3 綠色熒光蛋白信號(hào)的檢測(cè)72-73
• 3.6.4 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)73
• 3.7 CRISPR系統(tǒng)所需進(jìn)行的優(yōu)化(今后的工作計(jì)劃)73-76
• 3.7.1 gRNA中靶序列的改變73-74
• 3.7.2 Cas9基因前啟動(dòng)子的改變74-75
• 3.7.3 gRNA前啟動(dòng)子的改變75
• 3.7.4 轉(zhuǎn)化菌株的改變75-76
• 4 討論分析和展望76-81
• 4.1 耐輻射奇球菌drRRA突變株的蛋白質(zhì)組學(xué)分析76-78
• 4.2 耐輻射奇球菌基于CRISPR技術(shù)的新型基因敲除系統(tǒng)的構(gòu)建78-81
• 參考文獻(xiàn)81-95
• 碩士期間發(fā)表論文95

【相似文獻(xiàn)】

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2 楊橋;張曉玲;張俊祥;張磊;方呈祥;;耐輻射奇球菌抗輻射機(jī)制的代謝組學(xué)初步研究[A];2006中國(guó)微生物學(xué)會(huì)第九次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2006年

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6 張志東;茆軍;王瑋;唐琦勇;石玉瑚;;一株耐輻射菌的分離與初步鑒定[A];2008年中國(guó)微生物學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2008年

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9 馬云;何淑雅;李斌元;;耐輻射奇球菌Dps-2蛋白的互作蛋白篩選[A];第三次全國(guó)天然輻射照射與控制研討會(huì)論文匯編[C];2010年

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1 林琳;耐輻射奇球菌群體感應(yīng)系統(tǒng)及其在菌體氧化脅迫抗性中功能的研究[D];浙江大學(xué);2016年

2 張磊;耐輻射奇球菌類胡蘿卜素合成途徑相關(guān)基因的研究以及兩個(gè)新種的多相分類鑒定[D];武漢大學(xué);2009年

3 劉程智;耐輻射奇球菌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)發(fā)掘及抗性相關(guān)基因功能研究[D];浙江大學(xué);2014年

4 程建徽;耐輻射奇球菌抗性相關(guān)蛋白DR1790與類胡蘿卜素的防護(hù)功能研究[D];浙江大學(xué);2014年

5 劉立麗;污染環(huán)境中～（95）Zr和耐輻射奇球菌的研究[D];浙江大學(xué);2004年

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中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 楊杰;輻照條件下典型微生物對(duì)水溶性核素鈾的吸附研究[D];西南科技大學(xué);2015年

2 范美婷;耐輻射奇球菌PprM、PprI和PprA對(duì)酵母輻射抗性影響及三者相互作用初步研究[D];南華大學(xué);2015年

3 胡菁;耐輻射奇球菌反應(yīng)調(diào)節(jié)基因突變體drRRA的蛋白質(zhì)組學(xué)研究及其基因編輯系統(tǒng)的探索[D];浙江大學(xué);2016年

4 張俊祥;抗氧化酶類和耐輻射奇球菌抗紫外輻射的研究[D];武漢大學(xué);2003年

5 孟玲;耐輻射奇球菌超氧化物歧化酶基因的克隆與表達(dá)[D];四川大學(xué);2005年

6 孫曉宇;耐輻射奇球菌pprI基因定點(diǎn)整合酵母菌的構(gòu)建及其相關(guān)抗逆性的研究[D];南華大學(xué);2012年

7 楊鵬;過氧化氫脅迫下耐輻射奇球菌中FMN riboswitch的功能研究[D];浙江理工大學(xué);2013年

8 胡雅萍;耐輻射奇球菌特種類胡蘿卜素工deinoxanthin藥理學(xué)活性的初步研究[D];浙江大學(xué);2011年

9 李順杰;耐輻射奇球菌抗輻射相關(guān)ncRNA的篩選驗(yàn)證和功能研究[D];浙江理工大學(xué);2011年

10 蔣亮;耐輻射奇球菌Dps-2蛋白的互作蛋白篩選[D];南華大學(xué);2010年

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本文編號(hào)：812468