發(fā)布時間：2017-09-07 21:10

  本文關(guān)鍵詞：蟲草素合成相關(guān)酶基因克隆與表達

  更多相關(guān)文章： 蝙蝠蛾擬青霉 蟲草素 轉(zhuǎn)錄組學 基因克隆 轉(zhuǎn)基因

【摘要】：蟲草素具有抗炎、抗腫瘤、抑制微生物生長等明顯的藥理活性,現(xiàn)已制作出多種以蟲草素為主要藥性成分的成藥,其臨床應(yīng)用前景非常廣闊,但由于其在蛹蟲草中含量很低,且人工合成困難,因而蟲草素價格不斷上揚,嚴重限制了其臨床應(yīng)用。因此研究通過生物學方法,使菌株自身蟲草素表達量提高,很大程度上將解決限制蟲草素應(yīng)用的關(guān)鍵問題。本研究利用蝙蝠蛾擬青霉菌(Paecilomyces hepiali)作為實驗菌種。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學和代謝組學的方法,對蟲草素的代謝途徑進行了探究。在已完成蝙蝠蛾擬青霉菌的全基因組測序和轉(zhuǎn)錄組信息初步分析的基礎(chǔ)上,進一步分析不同轉(zhuǎn)錄組差異表達基因,并將差異基因進行聚類分析。篩選得到140多個目標基因,這些基因都是參與核苷酸通路代謝的上調(diào)表達基因。隨后,結(jié)合STITCH化合物互作數(shù)據(jù)庫,在目標基因中選定了AMI、IMP、GMP這三個基因,作為后續(xù)研究中的擬定關(guān)鍵酶基因。分別設(shè)計各關(guān)鍵酶基因的特異性擴增引物,通過PCR擴增,對關(guān)鍵酶基因進行克隆,隨后將擴增所得片段整合至pMD18-T質(zhì)粒進行測序,回收測序結(jié)果與基因序列匹配的擴增產(chǎn)物。接著,通過In-fusion重組技術(shù),將目標基因分別整合到含有強啟動子35S的質(zhì)粒pCambia1300中。隨后,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入蝙蝠蛾擬青霉菌中。經(jīng)過多輪篩選,分別得到了AMI基因、IMP基因、GMP基因的可穩(wěn)定遺傳工程菌株,分別記為轉(zhuǎn)基因AMI組、轉(zhuǎn)基因IMP組以及轉(zhuǎn)基因GMP組。利用實時熒光定量PCR技術(shù),分別對三組工程菌中關(guān)鍵酶基因的表達量進行了測定。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因AMI組中,AMI基因表達量較陰性結(jié)果上調(diào)約2倍;轉(zhuǎn)基因IMP組中,IMP基因表達較陰性對照組提高并有極顯著性差異,上調(diào)達到近40倍;轉(zhuǎn)基因GMP組中,GMP基因表達較陰性對照組同樣明顯上調(diào)并有顯著性差異,上調(diào)約7倍。最后,利用液質(zhì)色譜聯(lián)用技術(shù),測定轉(zhuǎn)基因菌種培養(yǎng)液中的蟲草素含量。結(jié)果表明在代謝較為旺盛的第九天,轉(zhuǎn)基因AMI組和轉(zhuǎn)基因IMP組的蟲草素含量較陰性對照組提高了2倍,而轉(zhuǎn)基因GMP組的蟲草素含量較陰性對照組提高3倍之多。上述結(jié)果不但證實了選定的三個關(guān)鍵酶基因在蟲草素代謝途徑中的關(guān)鍵作用,也為研究蟲草素代謝途徑提供了理論基礎(chǔ),同時也為提高蟲草素表達量的研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：蝙蝠蛾擬青霉 蟲草素 轉(zhuǎn)錄組學 基因克隆 轉(zhuǎn)基因
【學位授予單位】：山東師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78
【目錄】：

• 中文摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 第一章 綜述11-18
• 1.1 冬蟲夏草11
• 1.2 蟲草素11-14
• 1.2.1 蟲草素的藥理作用11-12
• 1.2.2 蟲草素的臨床應(yīng)用12
• 1.2.3 蟲草素藥源問題研究12-13
• 1.2.4 蟲草素液體發(fā)酵生產(chǎn)的研究13-14
• 1.2.5 蟲草素微生物發(fā)酵生產(chǎn)的研究14
• 1.3 蝙蝠蛾擬青霉菌（Paecilomyces hepiali）14-15
• 1.4 代謝通路關(guān)鍵酶研究方法概述15-16
• 1.4.1 轉(zhuǎn)錄組測序預(yù)測關(guān)鍵酶基因15-16
• 1.4.2 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化(ATMT)16
• 1.5 論文主要研究目標，，內(nèi)容及研究意義16-18
• 1.5.1 論文研究目標16
• 1.5.2 論文研究內(nèi)容16-17
• 1.5.3 論文擬突破的難題17
• 1.5.4 論文的研究意義17-18
• 第二章 蟲草素合成相關(guān)酶基因的篩選18-34
• 前言18
• 2.1 實驗材料與主要試劑18
• 2.2 主要儀器18-19
• 2.3 本章技術(shù)路線19
• 2.4 實驗方法19-23
• 2.4.1 蝙蝠蛾擬青霉菌培養(yǎng)條件19-20
• 2.4.2 樣本選取20-21
• 2.4.3 轉(zhuǎn)錄本的重新預(yù)測與蛋白預(yù)測21-22
• 2.4.4 蟲草素代謝關(guān)鍵酶基因的確定22-23
• 2.4.5 根據(jù)化合物關(guān)系預(yù)測蟲草素合成途徑23
• 2.5 結(jié)果與分析23-32
• 2.5.1 基因預(yù)測23-24
• 2.5.2 基因和蛋白序列數(shù)據(jù)比對24-27
• 2.5.3 蛋白結(jié)構(gòu)域分析27-28
• 2.5.4 基因表達分析28-29
• 2.5.5 與蟲草素相關(guān)的Pathway分析29-30
• 2.5.6 蟲草素相關(guān)化合物的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)分析30-31
• 2.5.7 蟲草素代謝關(guān)鍵酶基因分析31-32
• 2.5.8 根據(jù)化合物關(guān)系預(yù)測蟲草素合成途徑32
• 2.6 討論32-34
• 第三章 關(guān)鍵酶基因的克隆與表達研究34-48
• 前言34
• 3.1 實驗材料34-35
• 3.2 主要儀器35
• 3.3 實驗方法35-43
• 3.3.1 In-fusion技術(shù)35
• 3.3.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法35-36
• 3.3.3 關(guān)鍵酶基因片段的獲得36-38
• 3.3.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建38-40
• 3.3.5 重組質(zhì)粒的篩選40-41
• 3.3.6 農(nóng)桿菌EHA105和LBA4404轉(zhuǎn)化效率的比較41
• 3.3.7 蝙蝠蛾擬青霉菌對潮霉素B的抗性濃度篩選41-42
• 3.3.8 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌42
• 3.3.9 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蝙蝠蛾擬青霉菌的轉(zhuǎn)化42-43
• 3.4 結(jié)果與分析43-46
• 3.4.1 蝙蝠蛾擬青霉菌RNA的提取43-44
• 3.4.2 關(guān)鍵酶基因的獲得44
• 3.4.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建44-45
• 3.4.4 兩種根癌農(nóng)桿菌對于蝙蝠蛾擬青霉菌轉(zhuǎn)化效率的比較實驗45
• 3.4.5 蝙蝠蛾擬青霉菌對潮霉素B的抗性濃度篩選45-46
• 3.4.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蝙蝠蛾擬青霉菌的轉(zhuǎn)化46
• 3.5 討論46-48
• 第四章 關(guān)鍵酶基因表達水平及蟲草素含量的測定48-57
• 前言48
• 4.1 實驗材料48
• 4.2 主要儀器48-49
• 4.3 突變菌株差異基因表達檢測49-50
• 4.3.1 熒光定量PCR49
• 4.3.2 RT-PCR檢測差異基因的m RNA表達49-50
• 4.4 轉(zhuǎn)基因菌株中蟲草素含量的測定50-52
• 4.4.1 UPLC ESI MS/MS簡述50-51
• 4.4.2 蟲草素含量的測定51-52
• 4.5 結(jié)果與分析52-56
• 4.5.1 突變菌株差異基因表達檢測部分52-54
• 4.5.2 蟲草素含量測定部分54-56
• 4.6 討論56-57
• 第五章 論文總結(jié)57-60
• 5.1 結(jié)論57-58
• 5.2 論文的創(chuàng)新之處58-59
• 5.3 今后的工作展望59-60
• 參考文獻60-67
• 附錄 1 表目錄67-68
• 附錄 2 圖目錄68-69
• 附錄 3 AMI基因序列69-70
• 附錄 4 IMP基因序列70-71
• 附錄 5 GMP基因序列71
• 附錄 6 擬定代謝圖中所涉及到的反應(yīng)71-75
• 致謝75

本文編號：809907