本文關(guān)鍵詞：脊尾白蝦蛻皮和性別調(diào)控相關(guān)基因的鑒定及功能分析

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【摘要】：脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)是我國重要的經(jīng)濟(jì)甲殼動(dòng)物,了解其內(nèi)分泌調(diào)控及性別調(diào)控機(jī)制在理論和實(shí)踐上具有重要的指導(dǎo)意義。甲殼動(dòng)物內(nèi)分泌調(diào)控是由多種激素協(xié)同作用,共同調(diào)控其蛻皮、生長、發(fā)育等生理過程。甲殼動(dòng)物的蛻皮和生長是密切相關(guān)的,甲殼動(dòng)物只有通過不斷蛻皮才能完成其生長和發(fā)育過程。對(duì)甲殼動(dòng)物性別分化和性別決定機(jī)制的研究是實(shí)現(xiàn)甲殼動(dòng)物性別控制的基礎(chǔ),一直是國際同行所關(guān)注的熱點(diǎn)問題。本論文利用脊尾白蝦為研究對(duì)象,鑒定了與蛻皮或性別發(fā)育相關(guān)的幾個(gè)重要功能基因,并對(duì)其功能進(jìn)行了初步分析,以期為闡明甲殼動(dòng)物的蛻皮調(diào)控和性別發(fā)育機(jī)制提供重要基礎(chǔ)。主要進(jìn)展簡述如下：甲殼動(dòng)物的蛻皮是與其生長、變態(tài)和繁殖密切相關(guān)的重要生理過程。前期的研究表明蛻皮過程是由20-羥基蛻皮酮(20E)及其上游的激素、多肽和環(huán)境因子共同調(diào)控的,然而對(duì)于20E調(diào)控的下游基因以及其在蛻皮中的功能仍不清楚。蛻殼激素基因(eclosion hormone, EH),又稱為羽化激素,最早是從飛蛾中分離得到的,隨后在其他昆蟲如煙草天蛾(Manduca sexta)、家蠶(Bombyx mori)、果蠅(Drosophila melanogaster)中都有報(bào)道。EH是由昆蟲的腹神經(jīng)細(xì)胞合成和分泌的一類神經(jīng)肽,在昆蟲蛻皮中起著重要的作用,至于EH在甲殼動(dòng)物蛻皮中的作用了解得很少。本論文從脊尾白蝦中獲得了與昆蟲的EH編碼基因具有一定相似性的序列(命名為EcEH),其開放閱讀框(ORF)為273bp,可編碼90個(gè)氨基酸；氨基酸序列包括一段疏水的信號(hào)肽,6個(gè)保守的半胱氨酸殘基,具有保守的eclosion結(jié)構(gòu)域。組織表達(dá)分析結(jié)果表明,EcEH轉(zhuǎn)錄本主要在鰓、表皮及眼柄中表達(dá)。EcEH在脊尾白蝦不同的蛻皮時(shí)期,其轉(zhuǎn)錄表達(dá)發(fā)生明顯的變化,在蛻皮前期(late premolt)表達(dá)量最高,而在其它蛻皮時(shí)期,其表達(dá)量維持在較低水平,提示其可能與蛻皮相關(guān)。利用RNAi干擾技術(shù)和外源20-羥基蛻皮酮(20E)激素注射的方法進(jìn)一步研究了EH在脊尾白蝦蛻皮中的功能, 結(jié)果表明注射EcEH的雙鏈RNA會(huì)導(dǎo)致蛻皮過程明顯延遲,注射外源的20E可以明顯加快蛻皮進(jìn)程。以上研究結(jié)果說明EcEH與脊尾白蝦的蛻皮密切相關(guān)。胰島素樣促雄性腺激素(Insulin-like androgenic gland hormone, IAG)由甲殼動(dòng)物雄性個(gè)體所獨(dú)有的促雄性腺(Angrogenic gland, AG)分泌,在雄性甲殼動(dòng)物的性別分化、雄性性征維持和精子發(fā)生中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。IAG基因在沼蝦、對(duì)蝦、蟹類中均有報(bào)道, 但是對(duì)其功能的研究相對(duì)較少。本論文從脊尾白蝦中克隆了IAG基因(EcIAG),并對(duì)其功能進(jìn)行了分析。EcIAG基因的ORF全長531bp,可編碼176個(gè)氨基酸；包括一段疏水的信號(hào)肽,6個(gè)保守的半胱氨酸殘基,具有保守結(jié)構(gòu)域(insulin-like IPRO16179)。EcIA G主要在雄性個(gè)體的促雄性腺(AG)及精巢(Te)中表達(dá)。原位雜交分析表明：EcIAG的轉(zhuǎn)錄本主要定位在促雄性腺細(xì)胞。對(duì)不同胚胎和幼體發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析結(jié)果表明,EcIAG在原腸期和仔蝦P2期有著較高表達(dá)。為了解眼柄內(nèi)分泌中心是否對(duì)EcIAG的表達(dá)具有調(diào)控作用,我們研究眼柄摘除對(duì)其表達(dá)的影響。結(jié)果表明：眼柄摘除后EcIAG的轉(zhuǎn)錄表達(dá)明顯提高,說明眼柄中存在調(diào)控IAG表達(dá)的激素。原位雜交的相關(guān)研究為理解甲殼動(dòng)物的性別分化調(diào)控通路提供了一定基礎(chǔ)。Sox9(SRY-box9)基因是一類與動(dòng)物性別決定基因SRY具有高度序列相似性的轉(zhuǎn)錄因子。基于Sox9在哺乳動(dòng)物等物種中參與性別調(diào)控過程,本研究嘗試探討EcSox9在促雄性腺中的表達(dá)分布情況及其與EcIAG之間的調(diào)控關(guān)系。本研究從脊尾白蝦中克隆獲得Sox9基因,其ORF全長672bp,編碼243個(gè)氨基酸；推導(dǎo)的氨基酸序列具有保守的HMG BOX結(jié)構(gòu)域。EcSox9轉(zhuǎn)錄本在各組織中廣泛存在,但在鰓及肝胰腺中表達(dá)量最高。EcSox9的表達(dá)隨著胚胎和幼體發(fā)育時(shí)期的推移而呈現(xiàn)表達(dá)增加的趨勢(shì)。EcSox9在摘除眼柄的脊尾白蝦促雄性腺中表達(dá)量增加,表明眼柄中可能存在內(nèi)分泌調(diào)控因子對(duì)EcSox9基因的表達(dá)具有調(diào)控作用。利用RNAi技術(shù)研究了EcSox9和EcIAG基因之間的關(guān)系,結(jié)果表明：注射EcSox9的雙鏈RNA(dsSox9)時(shí),EcIAG的表達(dá)量顯著降低,表明EcSox9可能對(duì)EcIAG的表達(dá)存在正調(diào)控的關(guān)系；而在注射EcIAG的雙鏈dsIAG時(shí),EcSox9的表達(dá)量卻顯著升高,表明EcIAG的表達(dá)水平對(duì)EcSox9的表達(dá)存在反饋調(diào)控作用。相關(guān)研究結(jié)果為闡明Sox9在甲殼動(dòng)物性別決定中的作用提供了重要資料。
【關(guān)鍵詞】：脊尾白蝦 EH基因 IAG基因 Sox9基因 蛻皮 性別決定
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院研究生院(海洋研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q953
【目錄】：

• 致謝4-6
• 摘要6-8
• Abstract8-15
• 第一章 緒論15-33
• 1.1 甲殼動(dòng)物內(nèi)分泌調(diào)控系統(tǒng)的研究進(jìn)展和現(xiàn)狀15-20
• 1.1.1 甲殼動(dòng)物內(nèi)分泌調(diào)控相關(guān)的內(nèi)分泌器官15-16
• 1.1.2 甲殼動(dòng)物內(nèi)分泌調(diào)控的相關(guān)激素16-18
• 1.1.3 甲殼動(dòng)物內(nèi)分泌調(diào)控途徑的相關(guān)假說18-20
• 1.1.4 甲殼動(dòng)物內(nèi)分泌調(diào)控的環(huán)境影響因子20
• 1.2 蛻皮過程的研究進(jìn)展20-27
• 1.2.1 蛻皮及蛻皮周期的分類20-22
• 1.2.2 蛻皮過程及內(nèi)分泌調(diào)控關(guān)系22-24
• 1.2.3 昆蟲的蛻皮調(diào)控機(jī)制與甲殼類的蛻皮機(jī)制24-26
• 1.2.4 昆蟲與甲殼動(dòng)物的內(nèi)分泌學(xué)(蛻皮與生長繁殖)比較26-27
• 1.3 甲殼動(dòng)物性別決定及性別分化研究進(jìn)展27-29
• 1.3.1 性別決定機(jī)制與性別分化的相關(guān)基因27-28
• 1.3.2 蝦類性別決定及性別分化的研究進(jìn)展28-29
• 1.4 甲殼動(dòng)物內(nèi)分泌調(diào)控及性別決定與性別分化的關(guān)系29-30
• 1.5 本研究的目標(biāo)及意義30-31
• 1.6 本研究的主要內(nèi)容和技術(shù)路線31-33
• 第二章 脊尾白蝦EH基因的鑒定及功能分析33-57
• 2.1 材料和方法33-47
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物33
• 2.1.2 組織取樣33
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑33-34
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器34-35
• 2.1.5 總RNA的提取及cDNA的合成35-36
• 2.1.6 基因的克隆及序列分析36-38
• 2.1.7 熒光實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative PCR,qPCR)38-39
• 2.1.8 原位雜交39-44
• 2.1.9 dsEH的合成44-45
• 2.1.10 dsRNA與20E劑量的最優(yōu)化45-46
• 2.1.11 dsRNA與20E對(duì)蛻皮過程的影響46
• 2.1.12 dsRNA與20E對(duì)蛻皮率的影響46-47
• 2.2 結(jié)果與分析47-54
• 2.2.1 脊尾白蝦EH基因的鑒定、結(jié)構(gòu)分析及親緣關(guān)系分析47-49
• 2.2.2 脊尾白蝦EH基因在不同組織的表達(dá)特征分析49-50
• 2.2.3 脊尾白蝦EH基因在不同蛻皮階段的表達(dá)特征分析50-51
• 2.2.4 脊尾白蝦dsEH干擾或20E激素注射對(duì)EH基因的表達(dá)特征分析51-52
• 2.2.5 脊尾白蝦dsEH干擾或20E激素注射對(duì)蛻皮過程的影響52-53
• 2.2.6 脊尾白蝦dsEH干擾或20E激素注射對(duì)蛻皮率的影響53-54
• 2.3 討論54-57
• 第三章 脊尾白蝦IAG基因的鑒定及功能分析57-73
• 3.1 材料與方法57-63
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物57
• 3.1.2 組織取樣57
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑57
• 3.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器57-58
• 3.1.5 總RNA的提取及cDNA的合成58
• 3.1.6 基因克隆及序列分析58-59
• 3.1.7 定量PCR(qPCR檢測(cè))59-60
• 3.1.8 原位雜交60-61
• 3.1.9 dsIAG的合成61-62
• 3.1.10 dsRNA干擾劑量最優(yōu)化62
• 3.1.11 眼柄切除之后,AG的形態(tài)學(xué)觀察,組織定位及IAG表達(dá)變化62-63
• 3.2 結(jié)果與分析63-70
• 3.2.1 脊尾白蝦IAG基因的鑒定、結(jié)構(gòu)分析及親緣關(guān)系分析63-66
• 3.2.2 脊尾白蝦IAG基因在不同組織的表達(dá)特征分析66-67
• 3.2.3 脊尾白蝦IAG基因在早期不同發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)特征分析67-68
• 3.2.4 脊尾白蝦的眼柄摘除,AG的形態(tài)學(xué)觀察、組織定位及表達(dá)特征68-70
• 3.3 討論70-73
• 第四章 脊尾白蝦Sox9基因的鑒定及功能分析73-87
• 4.1 材料與方法73-78
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物73
• 4.1.2 組織取樣73
• 4.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑73
• 4.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器73
• 4.1.5 總RNA的提取及cDNA的合成73-74
• 4.1.6 基因克隆及序列分析74-76
• 4.1.7 定量PCR(RT-qPCR檢測(cè))76-77
• 4.1.8 dsSox9的合成77
• 4.1.9 dsSox9干擾劑量的最優(yōu)化77-78
• 4.2 結(jié)果與分析78-85
• 4.2.1 脊尾白蝦Sox9基因的鑒定、結(jié)構(gòu)分析及親緣關(guān)系分析78-81
• 4.2.2 脊尾白蝦Sox9基因在不同組織的表達(dá)特征分析81-82
• 4.2.3 脊尾白蝦Sox9基因在早期不同發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)特征分析82-83
• 4.2.4 脊尾白蝦Sox9基因在雄性脊尾白蝦促雄性腺的表達(dá)特征分析83-84
• 4.2.5 脊尾白蝦dsSox9及dsIAG梯度劑量最優(yōu)化及相互調(diào)控關(guān)系84-85
• 4.3 討論85-87
• 結(jié)論87-89
• 參考文獻(xiàn)89-105
• 個(gè)人簡歷105-107
• 碩士期間發(fā)表論文與研究成果107

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