本文關(guān)鍵詞：草魚cadm2b基因的克隆及在成體組織中的表達分析

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【摘要】：CADMs (cell adhesion molecules)家族是一類脊椎動物特有的多功能細胞黏附因子。由于其具有介導(dǎo)免疫肥大細胞識別和黏附靶細胞的功能,在脊椎動物構(gòu)建抵御病害感染的第一道防線中發(fā)揮重要作用。為研究CADMs在草魚構(gòu)建抵御病害感染的第一道防線中起作用,我們克隆了草魚cadm2b的mRNA。用RT-PCR和RACE方法結(jié)合測序分析,我們在草魚腦組織中檢測到了該基因4條不同的cDNA全長序列。序列比對結(jié)果表明這4條全長cDNA在5’端的序列完全相同,在3’端的3個局部區(qū)域有不同片段的缺失。因此,可以確定這4條不同的mRNA是cadm2b的不同剪接體。這4條不同的剪接體被分別命名為cadm2b、 cadm2bX2、cadm2bX3和cadm2bX6、cadm2b的cDNA序列全長1669bp,開放閱讀框(ORF)1203bp,編碼400個氨基酸。cadm2b X2的cDNA序列全長2783bp,開放閱讀框長1323bp,編碼440個氨基酸;cadm2b X3的cDNA序列全長2755bp,開放閱讀框1296bp,編碼431個氨基酸；cadm2b X6基因的cDNA序列全長2649bp,開放閱讀框1161bp,編碼386個氨基酸。根據(jù)堿基序列所進行的氨基酸序列和蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示這四個CADM2b蛋白亞型都具有CADM家族保守的4個功能區(qū),但其C端的蛋白結(jié)合位點存在差異。CADM2b具有近膜4.1蛋白結(jié)合位點和Ⅱ型PDZ蛋白結(jié)合位點,CADM2bX2、X3缺失了PDZ蛋白結(jié)合位點,而CADM2bX6則同時缺失4.1蛋白和PDZ蛋白的結(jié)合位點。實時定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示cadm2b剪接突變體是該基因mRNA的主要形式。半定量RT-PCR和套式PCR實驗檢測結(jié)果表明cadm2b基因在草魚成體腦中高水平表達,在肝、腎、心臟和肌肉組織中有微量表達。這種表達模式提示草魚中CADM2b主要是由非免疫細胞,而不是由免疫肥大細胞合成分泌的細胞粘附因子,可能通過介導(dǎo)免疫肥大細胞與病原靶細胞的黏附而起非特異性抵御病害感染的作用。
【關(guān)鍵詞】：草魚 cadm2b 基因克隆 表達
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4;Q78
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 第一章 引言12-31
• 1.1 CADMs家族研究進展12-25
• 1.1.1 CADMs家族的發(fā)現(xiàn)與各成員的表達模式12-14
• 1.1.2 CADMs家族結(jié)構(gòu)特點14-18
• 1.1.2.1 CADMs家族胞外結(jié)構(gòu)域14-17
• 1.1.2.2 CADMs家族胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域17-18
• 1.1.3 CADMs家族的多種生理功能18-25
• 1.1.3.1 免疫相關(guān)功能18-19
• 1.1.3.2 神經(jīng)系統(tǒng)中的作用19-21
• 1.1.3.3 CADMs在腫瘤中的相關(guān)生理作用21-24
• 1.1.3.4 CADM1與雄性不育和雌性性別發(fā)育異常24-25
• 1.2 RNA可變剪接概述25-30
• 1.2.1 RNA剪接體的組成25
• 1.2.2 剪接體的剪接機制25-27
• 1.2.2.1 剪接相關(guān)的內(nèi)含子保守序列26
• 1.2.2.2 剪接體的組裝與剪接過程26-27
• 1.2.3 選擇性剪接的常見分類27-28
• 1.2.4 選擇性剪接作用的調(diào)控因素28-30
• 1.2.4.1 剪接增強子和剪接沉默子對剪接作用的調(diào)控28-29
• 1.2.4.2 其他影響選擇性剪接的因素29-30
• 1.3 本研究的目的和意義30-31
• 第二章 材料與方法31-49
• 2.1 材料31-32
• 2.1.1 實驗材料31
• 2.1.2 主要試劑31
• 2.1.3 主要儀器31-32
• 2.2 方法32-49
• 2.2.1 提取草魚組織總RNA與基因組DNA32-35
• 2.2.1.1 提取草魚組織總RNA32-34
• 2.2.1.2 提取草魚基因組DNA34-35
• 2.2.2 草魚cadm2b cDNA的克隆35-45
• 2.2.2.1 草魚腦組織第一鏈cDNA的合成35-36
• 2.2.2.2 克隆草魚cadm2b cDNA引物的設(shè)計36-38
• 2.2.2.3 草魚cadm2b全長cDNA的克隆38-42
• 2.2.2.4 PCR產(chǎn)物的凝膠回收42-43
• 2.2.2.5 制備和轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞43-45
• 2.2.2.6 目的片段的連接45
• 2.2.3 草魚cadm2b cDNA蛋白質(zhì)序列預(yù)測及系統(tǒng)進化分析45
• 2.2.4 草魚cadm2b在不同組織器官中的表達分析45-49
• 第三章 實驗結(jié)果49-69
• 3.1 草魚cadm2b cDNA全序列克隆與蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測49-63
• 3.1.1 草魚cadm2b以及cadm2b轉(zhuǎn)錄突變體全長cDNA的克隆49-60
• 3.1.2 草魚cadm2b蛋白功能結(jié)構(gòu)預(yù)測與聚類分析60-63
• 3.2 草魚cadm2b在草魚成體組織中的表達分析63-69
• 3.2.1 草魚cadm2b在成體組織中的半定量檢測63-66
• 3.2.2 草魚cadm2b在成體草魚組織中的實時熒光定量分析66-69
• 3.2.2.1 草魚cadm2b實時熒光定量引物確定66-67
• 3.2.2.2 草魚成體組織中cadm2b與cadm2bX2定量結(jié)果67-69
• 第四章 結(jié)果與討論69-75
• 4.1 本文研究的主要結(jié)果69-70
• 4.2 草魚cadm2b四個蛋白亞型可能的功能差異70-71
• 4.3 草魚基因組中cadm2b前體mRNA上可能有三個選擇性剪接位點71
• 4.4 草魚cadm2b多蛋白亞型表達模式原因分析71-73
• 4.5 草魚cadm2b基因可能在成體不同組織中介導(dǎo)細胞黏附73
• 4.6 存在的問題與進一步研究設(shè)想73-75
• 參考文獻75-84
• 附錄84

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1 梁健嘉;草魚cadm2b基因的克隆及在成體組織中的表達分析[D];浙江大學;2016年

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本文編號：802894