本文關(guān)鍵詞：ThCAP基因?qū)λ镜倪z傳轉(zhuǎn)化及其啟動(dòng)子功能研究

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【摘要】：水稻是我國(guó)重要糧食作物之一,對(duì)保障國(guó)家糧食安全做出突出貢獻(xiàn)。近年,黑龍江省提出“千億斤糧食產(chǎn)能工程”,水稻的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)將是其重要保障。然而,黑龍江省地處寒地,低溫冷害影響了水稻生產(chǎn)。因此,開展抗冷基因及其啟動(dòng)子功能研究,不僅可為植物基因工程育種提供具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良基因及啟動(dòng)子,同時(shí)也可為植物抗冷機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。本研究采用的檉柳冷適應(yīng)蛋白ThCAP基因(登錄號(hào):AY587773),屬于COR413基因家族成員之一。前期研究結(jié)果表明該基因的過(guò)表達(dá)能夠提高山新楊(P.davidiana×P.bolleana)抵御冷脅迫的能力,且效果顯著,但其在水稻中及其啟動(dòng)子的生物學(xué)功能未知。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法進(jìn)一步研究該基因及其啟動(dòng)子的功能。主要研究結(jié)果如下:1.構(gòu)建pCUbi1390-ThCAP植物表達(dá)載體,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,獲得轉(zhuǎn)ThCAP基因水稻抗性植株26個(gè),通過(guò)PCR檢測(cè)有18個(gè)為陽(yáng)性植株,RT-PCR以及Western Blot試驗(yàn)證明該基因在水稻中能夠正常轉(zhuǎn)錄,并翻譯成正確的蛋白質(zhì)。2.對(duì)5個(gè)T2代轉(zhuǎn)基因植株低溫處理試驗(yàn)表明,在正常生長(zhǎng)條件下,轉(zhuǎn)ThCAP基因水稻植株脯氨酸含量、MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓隉o(wú)顯著差異;低溫處理7d后,轉(zhuǎn)基因水稻脯氨酸含量顯著高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?MDA含量、相對(duì)電導(dǎo)率顯著低于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓辍？梢?ThCAP基因的表達(dá),提高了轉(zhuǎn)基因水稻抵抗低溫的能力。3.利用染色體步移技術(shù)從檉柳基因組中克隆出ThCAP基因上游序列1538bp的啟動(dòng)子候選片段。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè),該序列存在多種植物通用啟動(dòng)子元件及與非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件,表明該序列具有啟動(dòng)子的一般生物學(xué)功能。4.依據(jù)順式作用元件的位置,構(gòu)建ThCAP基因啟動(dòng)子的5’端缺失片段的GUS瞬時(shí)表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化擬南芥,低溫條件下進(jìn)行GUS誘導(dǎo)表達(dá)。組織化學(xué)染色結(jié)果表明,ThCAP基因啟動(dòng)子1538bp-900bp為冷響應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域。在該區(qū)域之間存在DREB/CBF、bZIP、MYB類轉(zhuǎn)錄因子的順式作用元件。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步闡明ThCAP基因表達(dá)調(diào)控途徑奠定基礎(chǔ)。本研究通過(guò)對(duì)水稻進(jìn)行ThCAP基因的遺傳轉(zhuǎn)化及功能分析,明確ThCAP基因的過(guò)表達(dá),可提高轉(zhuǎn)基因水稻抵抗低溫的能力。在此基礎(chǔ)上,本文又克隆了ThCAP基因啟動(dòng)子區(qū)域,確定了該啟動(dòng)子具有啟動(dòng)子的一般生物學(xué)功能,同時(shí)通過(guò)對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行系列片段缺失分析,推測(cè)ThCAP基因啟動(dòng)子1538 bp-900 bp為冷響應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域。在該區(qū)域之間存在DREB/CBF、bZIP、MYB類轉(zhuǎn)錄因子的順式作用元件。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步闡明ThCAP基因表達(dá)的調(diào)控途徑奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：ThCAP基因 轉(zhuǎn)基因 水稻 啟動(dòng)子
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 第一章 文獻(xiàn)綜述10-16
• 1.1 低溫脅迫和植物耐低溫機(jī)理的研究進(jìn)展10-12
• 1.1.1 低溫脅迫與細(xì)胞膜10
• 1.1.2 低溫脅迫與抗氧化調(diào)節(jié)10-11
• 1.1.3 低溫脅迫與植物細(xì)胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)11-12
• 1.1.4 低溫脅迫與激素調(diào)節(jié)12
• 1.2 植物冷誘導(dǎo)COR基因的研究概況12-13
• 1.3 COR413蛋白家族13-14
• 1.3.1 COR413基因的發(fā)現(xiàn)13
• 1.3.2 COR413蛋白的分類和組織特異性13-14
• 1.3.3 COR413蛋白的結(jié)構(gòu)14
• 1.3.4 COR413蛋白的功能預(yù)測(cè)14
• 1.4 本研究的目的和意義14-16
• 第二章 檉柳ThCAP基因的水稻遺傳轉(zhuǎn)化及分子生物學(xué)檢測(cè)16-32
• 2.1 材料與方法16-24
• 2.1.1 植物材料、菌株和質(zhì)粒16
• 2.1.2 主要試劑和儀器16-17
• 2.1.3 方法17-24
• 2.2 結(jié)果與分析24-29
• 2.2.1 ThCAP基因的擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的雙酶切鑒定24-26
• 2.2.2 工程菌的獲得及檢測(cè)26
• 2.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化26-27
• 2.2.4 轉(zhuǎn)ThCAP基因水稻植株P(guān)CR檢測(cè)27
• 2.2.5 轉(zhuǎn)ThCAP基因水稻植株RT-PCR檢測(cè)27-28
• 2.2.6 轉(zhuǎn)ThCAP基因水稻植株Western Blot檢測(cè)28-29
• 2.3 討論29
• 2.4 小結(jié)29-32
• 第三章 轉(zhuǎn)ThCAP水稻耐冷性分析32-38
• 3.1 材料與方法32-33
• 3.1.1 植物材料32
• 3.1.2 主要試劑和儀器32
• 3.1.3 轉(zhuǎn)基因植株耐低溫脅迫實(shí)驗(yàn)32-33
• 3.1.4 統(tǒng)計(jì)分析33
• 3.2 結(jié)果與分析33-35
• 3.2.1 轉(zhuǎn)ThCAP基因水稻脯氨酸含量分析33-34
• 3.2.2 轉(zhuǎn)ThCAP基因水稻丙二醛含量分析34-35
• 3.2.3 轉(zhuǎn)ThCAP基因水稻相對(duì)電導(dǎo)率分析35
• 3.3 討論35-36
• 3.4 小結(jié)36-38
• 第四章 檉柳ThCAP基因啟動(dòng)子的克隆及功能驗(yàn)證38-52
• 4.1 材料與方法38-46
• 4.1.1 材料38-39
• 4.1.2 方法39-46
• 4.2 結(jié)果與分析46-50
• 4.2.1 檉柳ThCAP基因 5′上游序列的克隆46
• 4.2.2 檉柳ThCAP基因啟動(dòng)子序列分析46-48
• 4.2.3 檉柳ThCAP基因啟動(dòng)子 5′系列缺失植物表達(dá)載體構(gòu)建48
• 4.2.4 轉(zhuǎn)ThCAP基因啟動(dòng)子系列缺失擬南芥株系的GUS染色48-49
• 4.2.5 ThCAP基因啟動(dòng)子中冷響應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域鑒定49-50
• 4.3 討論50-51
• 4.4 小結(jié)51-52
• 第五章 結(jié)論52-54
• 附錄54-58
• 參考文獻(xiàn)58-68
• 致謝68-70
• 作者簡(jiǎn)介70

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：783783