發(fā)布時間：2017-09-02 11:34

  本文關(guān)鍵詞：曼氏無針烏賊雌激素受體基因的克隆、表達及生殖調(diào)控功能初探

  更多相關(guān)文章： 曼氏無針烏賊 雌激素受體 基因克隆 亞細胞定位 生殖調(diào)控

【摘要】：曼氏無針烏賊(Sepiella japonica)是我國沿海海域最重要的海洋頭足類物種,現(xiàn)人工養(yǎng)殖已經(jīng)取得突破。但養(yǎng)殖過程中普遍出現(xiàn)的性早熟現(xiàn)象嚴重影響其養(yǎng)殖效果,因此揭示養(yǎng)殖條件下的烏賊生殖發(fā)育調(diào)控機制是解決這一問題的關(guān)鍵。雌激素受體(estrogen receptor,ER)是典型的性類固醇核受體,在許多海洋動物的性成熟和生殖發(fā)育中扮演著重要角色。鑒于ER可能也參與烏賊的生殖發(fā)育調(diào)控,本文首次開展了曼氏無針烏賊雌激素受體sjER基因克隆和序列特征分析、亞細胞定位和受體類型鑒定、可能作用位點及組織分布特征、在生殖周期中變動規(guī)律及在生殖發(fā)育中的調(diào)控功能等方面的研究。主要取得的研究結(jié)果如下:采用Illumina Hiseq 2000高通量測序技術(shù)構(gòu)建了曼氏無針烏賊未成熟和成熟卵巢轉(zhuǎn)錄表達譜數(shù)據(jù)庫,經(jīng)去冗余處理和拼接處理后,共計獲得70,039條Unigenes,均長800 bp,40.7%(28,492)Unigene獲得注釋信息,其中近38.5%(10,969)Unigene獲得GO分類注釋。篩選獲得了一批性腺發(fā)育相關(guān)基因序列,未成熟卵巢轉(zhuǎn)錄組中有793條高豐富表達(FPKM≥100)基因,成熟卵巢轉(zhuǎn)錄組中找到38條高豐富表達基因。成熟與未成熟階段卵巢轉(zhuǎn)錄組相比,基因表達顯著下調(diào)(P0.001)基因為46,071個,顯著上調(diào)基因為1,217個,其中ER在卵巢成熟階段基因表達量顯著上調(diào),注釋的ER基因序列與章魚的ER基因序列同源性高達80%以上。采用5'和3'RACE技術(shù)獲得了sjER的全長序列,并對其序列特征進行了分析,結(jié)果表明,sjER cDNA序列(KT278504)全長1,788 bp,包含280 bp的5'UTR,38 bp的3'UTR和1,470 bp的ORF,可編碼489個氨基酸。與其他核受體結(jié)構(gòu)一樣,sjER可分為:A/B區(qū)(N端,130aa),C區(qū)(DNA結(jié)合區(qū)DBD,80aa),D區(qū)(鉸鏈區(qū),35aa)、E區(qū)(配體結(jié)合區(qū)LBD,228aa)和F區(qū)(C端,16aa)。C區(qū)和E區(qū)高度保守,和真蛸ER相似性高達100%和96%。ER系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn),動物中雌激素受體明顯分為三支:脊椎動物雌激素受體(ERα、ERβ和ERγ),頭索動物雌激素受體和無脊椎動物雌激素受體。sjER和軟體動物聚為一支,與頭足類真蛸ER同源性高達89%。對sjER受體性質(zhì)及定位進行分析,結(jié)果表明,通過構(gòu)建sjER-EGFP表達載體,轉(zhuǎn)染至HEK293細胞中,用熒光染料DiI染膜、DAPI染核,在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)綠色熒光主要定位在核上,確定sjER定位于細胞核上,與sjER序列中存在兩個核定位信號NLS的預(yù)測結(jié)果相一致,表明sjER是一個核受體,可能通過配體依賴激活特定基因轉(zhuǎn)錄行使功能。對sjER表達的組織特異性及其隨性腺發(fā)育的波動規(guī)律進行研究,結(jié)果表明,熒光定量PCR方法檢測出sj ER基因在曼氏無針烏賊雌性和雄性不同組織器官中廣泛表達,在腦、性腺和肝等生殖發(fā)育相關(guān)組織中有較高的表達量,在其他組織中表達量相對較低。sjER的表達在烏賊的生殖發(fā)育周期中有明顯的波動,在卵子發(fā)生的卵原細胞階段,原生質(zhì)生長階段和間質(zhì)生長階段,sjER表達量隨卵子發(fā)生的推進而顯著上升(P0.05),到發(fā)育成熟階段即營養(yǎng)質(zhì)生長階段sjER表達量則顯著下降。烏賊生殖發(fā)育中sjER表達量變化與我們測定的卵巢中E2含量的變化趨勢一致,說明ER在頭足類性腺發(fā)育和成熟過程中可能扮演著重要角色。為探討sjER究竟如何行使烏賊生殖發(fā)育的調(diào)控功能,我們將ERE-pGL3和sjER-Flag共轉(zhuǎn)染到HEK293細胞中,研究雌激素和sjER是否通過雌激素反應(yīng)原件ERE的激活來行使核受體功能。結(jié)果表明,sjER-Flag的轉(zhuǎn)染能顯著促進ERE表達量的成倍增加(P0.05),該促進作用可被ER的特異性抑制劑Tamoxifen顯著抑制(P0.05),說明sjER對烏賊生殖發(fā)育的調(diào)控可能是通過sjER促進相關(guān)靶基因的ERE轉(zhuǎn)錄這一經(jīng)典核受體途徑來實現(xiàn)的。但添加17β-雌二醇(E2)并不能顯著提高sjER對ERE的激活作用(P0.05),可能說明sjER的轉(zhuǎn)錄激活作用不依賴于sjER與配體E2的結(jié)合,而是依賴類似于其它軟體動物ERs那樣的自激活作用。在Ca2+流和cAMP測定實驗中,E2的添加未能誘導sjER-Flag轉(zhuǎn)染的HEK293細胞胞內(nèi)出現(xiàn)cAMP和Ca2+第二信使,表明sjER可能并不能像許多高等動物ER那樣通過與膜受體的相互作用介導膜信號轉(zhuǎn)導途徑。本論文的研究結(jié)果對于今后進一步闡明曼氏無針烏賊等頭足類的生殖發(fā)育調(diào)控機制,掌握類固醇激素對頭足類及軟體動物性成熟的影響奠定基礎(chǔ)。同時,也為揭示曼氏無針烏賊等海洋頭足類人工養(yǎng)殖下的性早熟原理提供一定的理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：曼氏無針烏賊 雌激素受體 基因克隆 亞細胞定位 生殖調(diào)控
【學位授予單位】：浙江海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4
【目錄】：

• 摘要8-10
• ABSTRACT10-15
• 引言15-17
• 第一章 雌激素及其受體研究綜述17-23
• 1.1 雌激素在動物生殖發(fā)育中的調(diào)控作用17-18
• 1.2 雌激素受體ER介導雌激素生殖調(diào)控功能的信號傳遞途徑18-20
• 1.3 雌激素及其受體在海洋無脊椎動物中的研究進展20-23
• 1.3.1 雌激素在海洋無脊椎動物中的研究進展20-21
• 1.3.2 雌激素受體在海洋無脊椎動物中的研究進展21-23
• 第二章 基于轉(zhuǎn)錄組的曼氏無針烏賊生殖發(fā)育相關(guān)功能基因數(shù)據(jù)挖掘及雌激素受體ER基因解析23-31
• 2.1 材料與方法23-25
• 2.1.1 實驗材料23-25
• 2.1.2 總RNA提取25
• 2.1.3 轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建和測序25
• 2.1.4 數(shù)據(jù)分析和挖掘25
• 2.2 結(jié)果與分析25-29
• 2.2.1 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果統(tǒng)計25-28
• 2.2.2 unigene表達差異分析28
• 2.2.3 雌激素受體ER基因的數(shù)據(jù)挖掘和解析28-29
• 2.3 討論29-31
• 第三章 曼氏無針烏賊雌激素受體ER基因全序列的克隆和特征分析31-44
• 3.1 材料與方法31-37
• 3.1.1 實驗材料31-32
• 3.1.2 總RNA提取32
• 3.1.3 獲取sjER cDNA基因全長32-37
• 3.2 結(jié)果與分析37-42
• 3.2.1 RNA提取結(jié)果37-38
• 3.2.2 sjER cDNA基因擴增結(jié)果38
• 3.2.3 sjER cDNA基因全長序列的分析38-39
• 3.2.4 ER氨基酸同源序列分析39-40
• 3.2.5 ER系統(tǒng)發(fā)育分析40-42
• 3.3 討論42-44
• 第四章 曼氏無針烏賊雌激素受體的亞細胞定位和受體類型鑒定44-50
• 4.1 材料與方法44-47
• 4.1.1 實驗材料44-45
• 4.1.2 sjER-EGFP載體的構(gòu)建45-46
• 4.1.3 HEK293細胞培養(yǎng)、凍存和復(fù)蘇46
• 4.1.4 細胞轉(zhuǎn)染46-47
• 4.1.5 熒光染料核染和膜染47
• 4.2 結(jié)果與分析47-48
• 4.2.1 sjER-EGFP表達載體的構(gòu)建47
• 4.2.2 sjER在細胞中的定位47-48
• 4.3 討論48-50
• 第五章 雌激素受體ER在曼氏無針烏賊生殖軸中的分布及在性發(fā)育周期中的變動規(guī)律研究50-59
• 5.1 材料與方法50-55
• 5.1.1 實驗材料50-51
• 5.1.2 卵巢組織學觀測51-53
• 5.1.3 不同組織總RNA提取53
• 5.1.4 cDNA模板合成53
• 5.1.5 實時熒光定量PCR53-54
• 5.1.6 性類固醇激素雌二醇E2濃度測定54-55
• 5.2 結(jié)果與分析55-56
• 5.2.1 sjER在曼氏無針烏賊生殖軸中的分布55
• 5.2.2 sjER及雌激素E2在曼氏無針烏賊生殖周期中的協(xié)同變動規(guī)律55-56
• 5.3 討論56-59
• 5.3.1 sjER在曼氏無針烏賊生殖軸中的分布56-57
• 5.3.2 sjER在曼氏無針烏賊生殖周期中的變動規(guī)律及其與雌激素的關(guān)系57-59
• 第六章 曼氏無針烏賊雌激素受體ER介導的細胞信號轉(zhuǎn)導功能初探59-68
• 6.1 材料與方法59-63
• 6.1.1 實驗儀器59-60
• 6.1.2 實驗試劑60
• 6.1.3 實驗耗材60
• 6.1.4 ERE-pGL3載體的構(gòu)建60-61
• 6.1.5 Flag-sjER61-62
• 6.1.6 HEK293細胞培養(yǎng)、凍存和復(fù)蘇62
• 6.1.7 細胞轉(zhuǎn)染62
• 6.1.8 ERE-pGL3含量檢測62
• 6.1.9 Ca~(2+)流檢測62
• 6.1.10 cAMP含量檢測62-63
• 6.2 結(jié)果與分析63-65
• 6.2.1 曼氏無針烏賊雌激素受體激活ERE靶基因的作用特性分析63
• 6.2.2 Ca~(2+)檢測63-64
• 6.2.3 cAMP檢測64-65
• 6.3 討論65-68
• 6.3.1 曼氏無針烏賊雌激素受體激活ERE靶基因的作用特性分析65-66
• 6.3.2 雌激素受體介導的cAMP信號途徑及Ca~(2+)流的檢測66-68
• 參考文獻68-77
• 致謝77-78
• 在讀期間發(fā)表的學術(shù)論文及研究成果78

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本文編號：778341