本文關(guān)鍵詞：鋅對土壤菌群及抗生素抗性水平轉(zhuǎn)移有關(guān)基因的影響

  更多相關(guān)文章： 鋅 水平基因轉(zhuǎn)移 耐藥性 可移動遺傳元件 Miseq高通量測序 實時熒光定量PCR

【摘要】：抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes,ARGs)作為一種新型環(huán)境污染物,主要存在于微生物體內(nèi)或裸露在外,它不僅可以在環(huán)境中持久性殘留,而且還可以通過水平遷移在不同環(huán)境介質(zhì)中傳播、擴(kuò)散,產(chǎn)生潛在生態(tài)危害。土壤作為一種重要的環(huán)境介質(zhì),其中的重金屬和抗生素復(fù)合污染現(xiàn)象日趨嚴(yán)重,因此有必要對土壤環(huán)境中的抗生素抗性菌、抗性基因及可移動遺傳元件對重金屬的響應(yīng)特征進(jìn)行探究。本文針對土壤重金屬驅(qū)動抗生素抗性基因水平轉(zhuǎn)移傳播的現(xiàn)象,在實驗室條件下,向采集于國家種質(zhì)鎮(zhèn)江桑樹圃的土壤中噴施不同濃度的硫酸鋅溶液,處理不同時間后取樣分析。Miseq高通量測序結(jié)果表明,高濃度的重金屬鋅對土壤長時間處理會降低土壤微生物的多樣性和豐度,但在一定程度上能夠促進(jìn)抗性優(yōu)勢菌群的生長繁殖。不同濃度重金屬鋅處理的土壤樣品中,門水平上的物種類別差異不大,變形菌門(Proteobacteria)是所有樣品中的主要優(yōu)勢門類;在屬水平上,不同樣品所含的物種類別差異較大,但Flavisolibacter,芽單胞菌屬(Gemmatimonas),Gp4,Gp6為共同的優(yōu)勢屬類。聚類分析發(fā)現(xiàn),大多數(shù)重金屬鋅濃度相近的樣品之間微生物群落結(jié)構(gòu)相似度較高,但也有例外,比如重金屬鋅濃度為100和1000 mg/kg處理2個月的樣品2(100)和2(1000)相似度高于0.6。綜合分析表明,鋅離子濃度對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響要大于處理時間對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。利用抗生素選擇性培養(yǎng)基篩選法,從樣品中分離篩選出7株不同的抗生素抗性菌(分別命名為:C1、STZ2、S3、N2、G1、G2、G5),經(jīng)鑒定抗性菌C1、G2屬于假單胞菌屬(Pseudomonas sp.),N2、G1屬于芽孢桿菌屬(Bacillus sp.),S3屬于短波單胞菌屬(Brevundimonas sp.),STZ2屬于卡斯特蘭尼氏菌屬(Castellaniella sp.),G5屬于節(jié)桿菌屬(Arthrobactor sp.)。七種抗生素藥敏試驗結(jié)果表明,7株菌均有多重耐藥性和不同程度的重金屬鋅與抗生素交叉抗性;鋅離子與抗生素之間的相互作用(協(xié)同抗性或是協(xié)同殺菌)不僅與重金屬鋅的濃度有關(guān),而且與抗生素和細(xì)菌的種類也有關(guān)系。慶大霉素和新霉素與50~150 mg/kg的重金屬鋅共存時,對細(xì)菌STZ2和C1的生長曲線的影響主要表現(xiàn)為菌株的適應(yīng)期延長,對數(shù)期延后,穩(wěn)定期生長量減少。利用實時熒光定量PCR技術(shù)對土壤中包括氨基糖苷類抗性基因,可移動遺傳元件轉(zhuǎn)座子和Ⅰ類整合子的21個基因在內(nèi)的豐度進(jìn)行相對定量,發(fā)現(xiàn)氨基糖苷類抗性基因aacA/aphD,aac(6')-Iy,aac(6')-II,spcN,轉(zhuǎn)座酶基因tnpA和整合子基因int11均在重金屬鋅濃度為800和1000 mg/kg時基因豐度明顯上升,整合酶基因int11的豐度最高可達(dá)對照的1851倍。結(jié)果表明,環(huán)境中高濃度的重金屬鋅與氨基糖苷類抗性基因及可移動遺傳元件轉(zhuǎn)座子和整合子之間能夠形成共選擇作用,促使氨基糖苷類抗性基因與可移動遺傳元件轉(zhuǎn)座子和整合子的基因豐度上升,有利于可移動遺傳元件介導(dǎo)的氨基糖苷類抗性基因的水平轉(zhuǎn)移。以期為遏制氨基糖苷類抗生素抗性基因在土壤環(huán)境中的水平傳播擴(kuò)散提供重要的理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：鋅 水平基因轉(zhuǎn)移 耐藥性 可移動遺傳元件 Miseq高通量測序 實時熒光定量PCR
【學(xué)位授予單位】：江蘇科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：X53;X172
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 第1章 緒論13-23
• 1.1 重金屬污染的治理方法13
• 1.2 抗生素的種類和使用現(xiàn)狀13-15
• 1.3 重金屬和抗生素的復(fù)合污染15
• 1.4 土壤抗生素抗性基因的研究現(xiàn)狀15-20
• 1.4.1 抗生素抗性基因與抗性基因水平轉(zhuǎn)移機(jī)制15-17
• 1.4.2 土壤重金屬對抗生素抗性基因的影響17
• 1.4.3 可移動遺傳元件介導(dǎo)抗生素抗性基因的水平轉(zhuǎn)移17-19
• 1.4.4 抗生素抗性基因的研究手段19-20
• 1.5 研究目的與內(nèi)容20-23
• 1.5.1 研究目的20-21
• 1.5.2 研究內(nèi)容21-23
• 第2章 重金屬鋅對土壤微生物多樣性的影響23-33
• 2.1 土壤樣品的前處理23
• 2.2 Miseq測序?qū)嶒灹鞒?/span>23-24
• 2.2.1 基因組DNA抽提23
• 2.2.2 PCR擴(kuò)增23-24
• 2.2.3 熒光定量24
• 2.2.4 文庫的建立及Miseq上機(jī)測序24
• 2.3 生物信息分析流程與內(nèi)容24
• 2.4 結(jié)果與討論24-31
• 2.4.1 原始數(shù)據(jù)24
• 2.4.2 數(shù)據(jù)去雜24-25
• 2.4.3 序列信息和多樣性指數(shù)25-26
• 2.4.4 稀釋曲線26-27
• 2.4.5 門水平上的分類情況27-28
• 2.4.6 屬水平上的分類情況（heatmap）28-29
• 2.4.7 聚類分析(Cluster analysis)29-31
• 2.5 本章小結(jié)31-33
• 第3章 重金屬鋅對土壤微生物抗生素抗性水平的影響33-49
• 3.1 試驗材料33-35
• 3.1.1 土樣的來源33
• 3.1.2 主要試劑33-34
• 3.1.3 實驗儀器34
• 3.1.4 培養(yǎng)基34-35
• 3.2 試驗方法35-37
• 3.2.1 土樣的處理35
• 3.2.2 土壤抗生素抗性菌的分離純化與菌落計數(shù)35
• 3.2.3 菌落形態(tài)觀察35
• 3.2.4 抗性菌株的鑒定35-36
• 3.2.5 抗性菌株的交叉耐藥性測試36-37
• 3.3 結(jié)果與討論37-48
• 3.3.1 土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)37
• 3.3.2 重金屬鋅對土壤微生物抗生素抗性菌的影響37-39
• 3.3.3 抗性菌的篩選與形態(tài)特征39-40
• 3.3.4 生理生化鑒定結(jié)果40-41
• 3.3.5 基于 16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析41-43
• 3.3.6 藥敏試驗結(jié)果43-46
• 3.3.7 抗生素與不同濃度Zn~(2+)交叉對抗性菌株C1和STZ2生長的影響46-48
• 3.4 本章小結(jié)48-49
• 第4章 重金屬鋅對土壤細(xì)菌抗性基因及可移動遺傳元件豐度的影響49-61
• 4.1 試驗材料49-50
• 4.1.1 實驗試劑49
• 4.1.2 實驗儀器49-50
• 4.2 試驗方法50-51
• 4.2.1 土壤微生物核酸的提取50
• 4.2.2 抗生素抗性基因及可移動遺傳元件豐度的檢測50-51
• 4.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析51
• 4.3 試驗結(jié)果51-58
• 4.3.1 氨基糖苷類抗性基因的豐度變化51-54
• 4.3.2 可移動遺傳元件的豐度變化54-58
• 4.4 本章討論與小結(jié)58-61
• 結(jié)論61-63
• 參考文獻(xiàn)63-71
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文71-73
• 致謝73-74
• 詳細(xì)摘要74-78

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本文編號：770510