發(fā)布時(shí)間：2017-08-27 12:04

  本文關(guān)鍵詞：MicroRNA-99a通過BMPR2基因靶向調(diào)節(jié)大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的早期軟骨細(xì)胞分化

  更多相關(guān)文章： 間充質(zhì)干細(xì)胞 軟骨細(xì)胞分化 microRNA-99a BMPR2 骨形態(tài)發(fā)生蛋白Ⅱ型受體

【摘要】：目的間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是關(guān)節(jié)軟骨再生的重要來源,因?yàn)镸SCs具有軟骨細(xì)胞分化的潛能,并且易于獲取且可在體外擴(kuò)增。目前,可調(diào)節(jié)軟骨形成的特定micro RNAs(mi RNAs)尚未明確,其相關(guān)機(jī)制也未清晰,本研究旨在找出這些特定microRNAs并研究其機(jī)制。方法應(yīng)用Real-time PCR、Western blot、免疫熒光顯微技術(shù)和阿新藍(lán)染色分析早期軟骨細(xì)胞分化中mi RNAs、BMPR2、蛋白多糖、ACAN和COL2A1的表達(dá)水平。應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因分析驗(yàn)證miRNAs和BMPR2的靶向關(guān)系。結(jié)果mi RNAs通過與目標(biāo)mRNA結(jié)合來降低蛋白質(zhì)的合成,從而調(diào)節(jié)生物學(xué)過程。本研究中我們發(fā)現(xiàn),在挪威棕色大鼠(Rattus Novegicus)間充質(zhì)干細(xì)胞(rMSCs)早期軟骨細(xì)胞分化過程中,mi R-99a和miR-125b-3p的表達(dá)明顯升高。而抑制miR-99a,能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞早期分化過程中蛋白多糖的沉積,并增加ACAN和COL2A1的表達(dá)。因此,調(diào)低miR-99a的表達(dá)能夠促進(jìn)rMSCs的早期軟骨細(xì)胞分化。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測表明,miR-99a作用于骨形態(tài)發(fā)生蛋白Ⅱ型受體(bone morphogenetic protein receptor type 2,BMPR2)的3'-UTR上的一個(gè)假定的結(jié)合位點(diǎn),miR-99a的過表達(dá)能夠降低BMPR2蛋白的表達(dá)水平。在r MSCs早期軟骨細(xì)胞分化的過程中,總p38和p-p38的表達(dá)在分化的第7天和第14天時(shí)增加;而在r MSC早期軟骨細(xì)胞分化的過程中,總p38和p-p38蛋白下降的水平取決于miR-99a過表達(dá)的水平。在rMSC早期軟骨細(xì)胞分化過程中,BMPR2的沉默能夠逆轉(zhuǎn)mi R-99a對蛋白多糖沉積、ACAN、COL2A1以及總p38蛋白、p-p38蛋白表達(dá)的抑制作用。結(jié)論這個(gè)大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果,為miR-99a在早期軟骨細(xì)胞分化中所扮演的角色提供了實(shí)驗(yàn)證明,miR-99a通過直接作用于BMPR2基因在軟骨細(xì)胞分化的早期起到負(fù)調(diào)節(jié)因子的作用。
【關(guān)鍵詞】：間充質(zhì)干細(xì)胞 軟骨細(xì)胞分化 microRNA-99a BMPR2 骨形態(tài)發(fā)生蛋白Ⅱ型受體
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R684
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-10
• 第1章 引言10-12
• 第2章 材料與方法12-16
• 2.1 大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞（rMSC）的分離與培養(yǎng)12
• 2.2 軟骨細(xì)胞分化和細(xì)胞樣品制備12-13
• 2.3 提取RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析（qRT13
• 2.4 包裝慢病毒并進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染13-14
• 2.5 Western blot14
• 2.6 免疫熒光顯微技術(shù)檢測14
• 2.7 將軟骨細(xì)胞分化后的細(xì)胞進(jìn)行阿新藍(lán)染色14-15
• 2.8 構(gòu)建載體進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測15
• 2.9 統(tǒng)計(jì)分析15-16
• 第3章 結(jié)果16-26
• 3.1 大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞（r MSC）早期軟骨細(xì)胞分化過程中的6個(gè)miRNA的表達(dá)譜16-17
• 3.2 抑制MiR17-19
• 3.3 抑制MiR-99a使早期軟骨細(xì)胞分化過程中的ACAN和COL2A1表達(dá)增加19-20
• 3.4 確定BMPR2是否是mi R20-22
• 3.5 BMPR2的沉默逆轉(zhuǎn)了mi R-99a inhibitor對rMSC中蛋白多糖沉積的促進(jìn)作用22-23
• 3.6 BMPR2的沉默逆轉(zhuǎn)了miR-99a inhibitor對早期軟骨細(xì)胞分化過程中ACAN和COL2A1表達(dá)的促進(jìn)作用23-26
• 第4章 討論26-28
• 參考文獻(xiàn)28-32
• Table 1 Primers for quantitative real-time RT-PCR32-33
• Table 2 Primers for luciferase reporter construction33-34
• 讀研期間的科研成果34-36
• 致謝36-37

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本文編號：745464