本文關(guān)鍵詞：HPV16E6基因過表達(dá)載體構(gòu)建及對(duì)Me180細(xì)胞侵襲與遷移的影響

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【摘要】：目的:構(gòu)建HPV16E6過表達(dá)腺病毒載體,比較HPV16E6過表達(dá)組和空白載體組兩組與空白對(duì)照組Me180細(xì)胞侵襲與遷移能力的大小,以及E-cadherin m RNA、蛋白的表達(dá)及其啟動(dòng)子甲基化的狀態(tài),探究HPV16E6對(duì)宮頸癌Me180細(xì)胞侵襲與遷移能力的影響及其機(jī)制。方法:1.構(gòu)建HPV16E6腺病毒:將HPV16E6基因亞克隆至腺病毒穿梭質(zhì)粒p HBAd-MCMV-GFP,用Eco R I和Bam H I雙酶切判定、運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增并將其產(chǎn)物與p HBAd-MCMV-GFP結(jié)合并轉(zhuǎn)化大腸桿菌,檢測(cè)序列是否正確,然后取HPV16E6過表達(dá)腺病毒載體質(zhì)粒及骨架質(zhì)粒,用Lipofiter TM轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)將重組體腺病毒在293A細(xì)胞中的包裝擴(kuò)增純化;2.病毒轉(zhuǎn)染效果驗(yàn)證:將過表達(dá)HPV16E6腺病毒轉(zhuǎn)染的宮頸癌Me180細(xì)胞,空白腺病毒轉(zhuǎn)染的宮頸癌Me180細(xì)胞,以及未進(jìn)行腺病毒轉(zhuǎn)染的宮頸癌Me180細(xì)胞分成3組:HPV16E6過表達(dá)組、空白載體組以及空白對(duì)照組,用過表達(dá)HPV16E6基因的腺病毒及其空白腺病毒載體感染Me180細(xì)胞,36小時(shí)后觀察綠色熒光表達(dá)情況,觀察熒光效果并運(yùn)用Western-Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3組細(xì)胞中HPV16E6的表達(dá)來驗(yàn)證其轉(zhuǎn)染效果;3.細(xì)胞遷移與侵襲能力:運(yùn)用Traswell遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)HPV16E6基因?qū)m頸癌Me180細(xì)胞系遷移與侵襲能力的影響;4.機(jī)制研究:運(yùn)用RT-q PCR實(shí)驗(yàn)及Western-Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3組細(xì)胞中E-cadherin m RNA及其蛋白的表達(dá),分析HPV16E6基因?qū)e180細(xì)胞遷移與侵襲能力影響的機(jī)制,并進(jìn)一步運(yùn)用甲基化特異性PCR檢測(cè)三組細(xì)胞E-cadherin甲基化狀態(tài)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果:1.通過瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)、測(cè)序結(jié)果證實(shí)了攜帶HPV16E6序列穿梭載體構(gòu)建成功,熒光顯微鏡圖片及Western blot結(jié)果顯示過表達(dá)HPV16E6的腺病毒已成功轉(zhuǎn)染至宮頸癌Me180細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染效率高(80%-90%);2.Transwell遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)中,過表達(dá)HPV16E6腺病毒轉(zhuǎn)染宮頸癌Me180細(xì)胞后,同空白對(duì)照組相比較其細(xì)胞的遷移與侵襲能力顯著增強(qiáng)(P0.05),而空白載體組相對(duì)空白對(duì)照組,其細(xì)胞的侵襲與遷移能力無明顯改變(P0.05);3.RT-q PCR及Western-Blot實(shí)驗(yàn)中,過表達(dá)HPV16E6組同空白對(duì)照組相比較,其E-cadherin m RNA及其蛋白的表達(dá)呈顯著下降(P0.05),而空白載體組的與空白對(duì)照組相比較,其E-cadherin m RNA及其蛋白表達(dá)水平無明顯變化(P0.05);4.甲基化特異性PCR顯示,過表達(dá)HPV16E6組的細(xì)胞E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)呈完全甲基化狀態(tài),其甲基化程度明顯高于空白對(duì)照組(P0.05),而空白載體組甲基化程度與空白對(duì)照組相比較,無明顯差異性(P0.05)。結(jié)論:1..HPV16E6基因可能通過下調(diào)宮頸癌細(xì)胞系Me180中E-cadherin的表達(dá)水平增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞系Me180細(xì)胞遷移與侵襲能力,進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移;2.表觀遺傳學(xué)方面,HPV16E6基因可通過上調(diào)E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平從而抑制E-cadherin蛋白表達(dá),可能是逆轉(zhuǎn)宮頸癌侵襲與轉(zhuǎn)移的潛在關(guān)鍵點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：HPV16E6 宮頸癌 侵襲 遷移 E-cadherin
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.33
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-11
• 符號(hào)說明11-14
• 第1章 引言14-16
• 第2章 材料與方法16-34
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料16-18
• 2.1.1 細(xì)胞來源16
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑16-17
• 2.1.3 儀器和設(shè)備17-18
• 2.1.4 主要試劑的配制18
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法18-34
• 2.2.1 HPV16E6基因過表達(dá)腺病毒載體的構(gòu)建18-22
• 2.2.2 轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞22-23
• 2.2.3 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HPV16E6蛋白的表達(dá)23-26
• 2.2.4 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)26
• 2.2.5 Transwell測(cè)侵襲實(shí)驗(yàn)步驟26-27
• 2.2.6 Real-time qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三組細(xì)胞中E-cadherin mRNA表達(dá)27-29
• 2.2.7 Western blot檢測(cè)三組細(xì)胞中E-cadherin蛋白的表達(dá)29
• 2.2.8 甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)29-32
• 2.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法32-34
• 第3章 結(jié)果34-46
• 3.1 目的基因與載體雙酶切結(jié)果34
• 3.2 酶切PCR的鑒定結(jié)果34-35
• 3.3 pHBAd-MCMV-GFP-HPV16E6重組腺病毒質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果35-36
• 3.4 腺病毒滴度測(cè)定結(jié)果36
• 3.5 腺病毒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞Me180結(jié)果36-38
• 3.6 Western-Blot檢測(cè)HPV16E6蛋白結(jié)果38-39
• 3.7 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-41
• 3.8 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-42
• 3.9 熒光定量PCR檢測(cè)三組細(xì)胞E-cadherin mRNA的表達(dá)水平42-43
• 3.10 Western-Blot檢測(cè)E-cadherin蛋白在三組細(xì)胞中的表達(dá)43-45
• 3.11 甲基化特異性PCR結(jié)果45-46
• 第4章 討論46-50
• 4.1 HPV16E6與宮頸癌侵襲與轉(zhuǎn)移相關(guān)性46-47
• 4.2 HPV16E6調(diào)控E-cadherin參與EMT分子機(jī)制研究47-48
• 4.3 表觀遺傳學(xué)角度，HPV16E6參與宮頸癌侵襲與轉(zhuǎn)移的機(jī)制48-50
• 第5章 結(jié)論50-52
• 參考文獻(xiàn)52-56
• 綜述：人乳頭瘤病毒16E6癌蛋白與宮頸癌發(fā)生的分子56-64
• 參考文獻(xiàn)60-64
• 攻讀學(xué)位期間主要研究成果64-66
• 致謝66

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

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本文編號(hào)：732832