本文關(guān)鍵詞：凡納濱對(duì)蝦的FREP和SRB-Croquemort基因在對(duì)蝦免疫應(yīng)答中的相關(guān)研究

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【摘要】：凡納濱對(duì)蝦(Litopeneaus vannamei,L.vannamei)又稱(chēng)南美白對(duì)蝦,因其具有生長(zhǎng)速度較快,成年個(gè)體的體積較大,繁殖期的持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)、對(duì)蛋白質(zhì)的需求量相對(duì)較低,但肉品質(zhì)相對(duì)較高以及可在低鹽度與高密度的水域中養(yǎng)殖等優(yōu)點(diǎn),迅速成為我國(guó)乃至全世界蝦類(lèi)養(yǎng)殖數(shù)量最高的蝦類(lèi)之一,然而,隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大,養(yǎng)殖對(duì)蝦的病害問(wèn)題也逐漸嚴(yán)重,其中危害最為嚴(yán)重的是病毒和細(xì)菌,因此,研究對(duì)蝦的免疫防御機(jī)制,了解對(duì)蝦的免疫基礎(chǔ),對(duì)于對(duì)蝦的養(yǎng)殖具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本試驗(yàn)依據(jù)同源物種的基因序列設(shè)計(jì)引物,結(jié)合RACE技術(shù)克隆得到了凡納濱對(duì)蝦的兩個(gè)纖維蛋白原相關(guān)蛋白基因(LvFREP1和LvFREP2)和一個(gè)B類(lèi)清道夫受體Croquemort型基因(LvSRB-Croquemort)。通過(guò)生物信息學(xué)分析這幾個(gè)基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其同源性,再利用半定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)在鰓、肝胰腺、血淋巴、心臟、腸、肌肉、神經(jīng)組織等10個(gè)組織中的表達(dá)差異,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)在注射鰻弧菌(Vibrio anguillarum,V.anguillarum)、溶壁微球菌(Micrococcus lysoleikticus,M.lysodeikticus)和白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)后不同時(shí)間點(diǎn)凡納濱對(duì)蝦這三個(gè)基因的時(shí)空表達(dá)規(guī)律。此外,對(duì)LvSRB-Croquemort進(jìn)行dsRNA干擾沉默后并注射哈維氏弧菌(Vibro harveyi,V.harveyi)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)相關(guān)基因的表達(dá)規(guī)律,對(duì)這些基因做了初步的研究,得到了以下試驗(yàn)結(jié)果:(1)LvFREP1基因克隆得到的序列有三種,定義為L(zhǎng)vFREP1-1、LvFREP1-2和LvFREP1-3。LvFREP1-1的基因長(zhǎng)度為802bp,開(kāi)放閱讀框?yàn)?83bp,編碼260個(gè)氨基酸,LvFREP1-2的基因長(zhǎng)度為1714bp,開(kāi)放閱讀框?yàn)?689bp,編碼562個(gè)氨基酸;LvFREP1-3的基因長(zhǎng)度為1593bp,開(kāi)放閱讀框?yàn)?569bp,編碼522個(gè)氨基酸;LvFREP2基因序列長(zhǎng)度為942bp,開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)939bp,編碼312個(gè)氨基酸;LvSRB-Croquemort基因的編碼區(qū)長(zhǎng)度為1602bp,編碼533個(gè)氨基酸。(2)系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示:這三種基因都與對(duì)應(yīng)基因的日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeus japonicus)的同源性最高,與其他物種同源性都相對(duì)較低。(3)組織表達(dá)分布結(jié)果顯示:LvFREP1基因只在鰓、血淋巴、腸、心臟和神經(jīng)組織中被檢測(cè)到,其中在鰓中表達(dá)量最高;LvFREP2基因在血淋巴和鰓中表達(dá)量較高,其他組織表達(dá)量較少或者不表達(dá);LvSRB-Croquemort基因在所有檢測(cè)到的組織中均有表達(dá),在血淋巴和精巢中表達(dá)量最高。(4)病原刺激的時(shí)序表達(dá)結(jié)果顯示:LvFREP1基因在鰻弧菌刺激組中,其表達(dá)量逐漸升高,在48h時(shí)有所下降,在溶壁微球菌組中,其表達(dá)量逐漸升高,并且隨后差異達(dá)到顯著和極顯著,在白斑綜合征病毒組中在24h有所上升;LvFREP2基因的鰻弧菌組中在6h時(shí)其表達(dá)量顯著高于對(duì)照組,12h時(shí)表達(dá)量開(kāi)始降低,溶壁微球菌和白斑病毒刺激組在6h和48h均有表達(dá)高峰期;LvSRB-Croquemort基因,在鰻弧菌組中,其表達(dá)量在注射6h后達(dá)到最大,之后逐漸降,在溶壁微球菌組中,其表達(dá)量在48h才有比較明顯的上升;在白斑病毒組中,其表達(dá)量在先降低后上升。(5)用dsRNA干擾技術(shù)沉默LvSRB-Croquemort基因之后的結(jié)果顯示:對(duì)蝦的三種抗菌肽ALF,Crustin,Pen3的表達(dá)量在沉默該基因之后總體都有顯著下降的趨勢(shì),而其兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子中,Dorsal沒(méi)有顯著變化,Relish的表達(dá)量先降低后升高。以上結(jié)果表明:LvFREP1,LvFREP2,LvSRB-Croquemort基因都可能參與著對(duì)蝦對(duì)抗病原體刺激的先天性免疫反應(yīng)過(guò)程。
【關(guān)鍵詞】：凡納濱對(duì)蝦 模式識(shí)別受體(PRRs) FREP1 FREP2 SRB-Croquemort
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S917.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-24
• 1.1 凡納濱對(duì)蝦的生物學(xué)信息12-13
• 1.2 凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖病害防治現(xiàn)狀13-14
• 1.3 凡納濱對(duì)蝦免疫系統(tǒng)14-16
• 1.3.1 物理屏障14-15
• 1.3.2 體液免疫15
• 1.3.3 細(xì)胞免疫15-16
• 1.4 模式識(shí)別受體相關(guān)研究16-18
• 1.4.1 TLR16-17
• 1.4.2 CLR17
• 1.4.3 NLR17
• 1.4.4 RLR17-18
• 1.4.5 胞質(zhì)DNA識(shí)別分子18
• 1.5 對(duì)蝦免疫基因FREPS和SR-BS的研究進(jìn)展18-22
• 1.5.1 FREPs基因的研究進(jìn)展18-21
• 1.5.2 SR-Bs基因的研究進(jìn)展21-22
• 1.6 研究的目的和意義22-24
• 第二章 凡納濱對(duì)蝦LvFREP1基因克隆及表達(dá)分析24-39
• 2.1 試驗(yàn)材料25-26
• 2.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物25
• 2.1.2 試驗(yàn)中所用的細(xì)菌和病毒25
• 2.1.3 主要試劑和試劑盒25
• 2.1.4 主要的儀器設(shè)備25-26
• 2.2 試驗(yàn)方法26-30
• 2.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成26
• 2.2.2 總RNA提取26
• 2.2.3 cDNA的合成26-27
• 2.2.4 FREP1部分目的片段的擴(kuò)增27
• 2.2.5 利用RACE技術(shù)獲得目的基因的編碼區(qū)27-28
• 2.2.6 FREP1基因的生物信息學(xué)分析28-29
• 2.2.7 FREP1基因在各組織表達(dá)分析29
• 2.2.8 FREP1基因在不同病原刺激后的時(shí)序表達(dá)29-30
• 2.3 結(jié)果與分析30-36
• 2.3.1 DNA產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果30
• 2.3.2 凡納濱對(duì)蝦FREP1基因生物信息分析30-35
• 2.3.3 FREP1基因在各組織內(nèi)的表達(dá)觀察35-36
• 2.3.4 FREP1基因?qū)Σ煌≡w刺激的時(shí)序表達(dá)36
• 2.4 討論36-38
• 2.5 小結(jié)38-39
• 第三章 凡納濱對(duì)蝦LvFREP2基因克隆及表達(dá)分析39-50
• 3.1 試驗(yàn)材料40
• 3.2 試驗(yàn)方法40-42
• 3.2.1 總RNA提取及cDNA合成40
• 3.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成40
• 3.2.3 基因片段克隆40-41
• 3.2.4 電泳檢測(cè)41
• 3.2.5 目的片段回收41
• 3.2.6 連接轉(zhuǎn)化41
• 3.2.7 陽(yáng)性克隆篩選41-42
• 3.2.8 LvFREP2基因的生物信息學(xué)分析42
• 3.2.9 LvFREP2基因?qū)Σ煌≡w的時(shí)序表達(dá)42
• 3.2.10 LvFREP2基因在各組織的表達(dá)42
• 3.3 結(jié)果與分析42-48
• 3.3.1 凡納濱對(duì)蝦引物檢測(cè)42-43
• 3.3.2 凡納濱對(duì)蝦目的片段回收43
• 3.3.3 克隆篩選結(jié)果43-44
• 3.3.4 LvFREP2基因序列分析44-45
• 3.3.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析45-47
• 3.3.6 LvFREP2基因?qū)Σ煌≡w刺激的時(shí)序表達(dá)47-48
• 3.3.7 LvFREP2基因在各組織中表達(dá)分析48
• 3.4 討論48-49
• 3.5 小結(jié)49-50
• 第四章 凡納濱對(duì)蝦LvSR-B Croquemort基因在免疫應(yīng)答中的相關(guān)研究50-62
• 4.1 試驗(yàn)材料51
• 4.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物51
• 4.1.2 試驗(yàn)中所用到病原51
• 4.1.3 試驗(yàn)儀器和試劑51
• 4.2 試驗(yàn)方法51-55
• 4.2.1 總RNA的提取及第一條cDNA的合成51
• 4.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成51-52
• 4.2.3 SR-B Croquemort基因部分片段的擴(kuò)增52-53
• 4.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)、回收及連接轉(zhuǎn)化53
• 4.2.5 通過(guò)RACE技術(shù)獲得目的基因的編碼區(qū)53
• 4.2.6 SR-B Croquemort基因的生物信息學(xué)分析53
• 4.2.7 SR-B Croquemort基因的組織表達(dá)53
• 4.2.8 SR-B Croquemort基因?qū)Σ煌≡w的時(shí)序表達(dá)53-54
• 4.2.9 SR-B Croquemort基因dsRNA的體外模板合成、轉(zhuǎn)錄純化及沉默該基因后相關(guān)基因的表達(dá)變化54-55
• 4.3 結(jié)果與分析55-60
• 4.3.1 LvSRB Croquemort基因的編碼區(qū)序列及其對(duì)應(yīng)的核酸序列55-56
• 4.3.2 LvSRB-Croquemort基因的多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析56-58
• 4.3.3 LvSRB-Croquemort基因在各組織內(nèi)的表達(dá)觀察58
• 4.3.4 LvSRB-Croquemort基因?qū)Σ煌≡w刺激的時(shí)序表達(dá)58-59
• 4.3.5 LvSRB-Croquemort基因通過(guò)dsRNA沉默后相關(guān)基因的表達(dá)59-60
• 4.4 討論60-61
• 4.5 小結(jié)61-62
• 第五章 結(jié)論、創(chuàng)新點(diǎn)和展望62-63
• 結(jié)論62
• 創(chuàng)新點(diǎn)62
• 研究展望62-63
• 參考文獻(xiàn)63-70
• 附錄70-74
• 縮略詞74-75
• 致謝75-76
• 作者簡(jiǎn)介76

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1 林惠山;戚雋淵;喬燕平;;凡納濱對(duì)蝦高產(chǎn)養(yǎng)殖水質(zhì)優(yōu)化技術(shù)探討[J];水產(chǎn)科技情報(bào);2006年04期

2 衣萌萌;于赫男;林小濤;許忠能;周小壯;;密度脅迫下凡納濱對(duì)蝦的行為與生理變化[J];暨南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版);2012年01期

3 周歧存,丁q，

本文編號(hào)：726967