本文關(guān)鍵詞：凡納濱對蝦的FREP和SRB-Croquemort基因在對蝦免疫應(yīng)答中的相關(guān)研究

  更多相關(guān)文章： 凡納濱對蝦 模式識別受體(PRRs) FREP1 FREP2 SRB-Croquemort

【摘要】：凡納濱對蝦(Litopeneaus vannamei,L.vannamei)又稱南美白對蝦,因其具有生長速度較快,成年個體的體積較大,繁殖期的持續(xù)時間較長、對蛋白質(zhì)的需求量相對較低,但肉品質(zhì)相對較高以及可在低鹽度與高密度的水域中養(yǎng)殖等優(yōu)點,迅速成為我國乃至全世界蝦類養(yǎng)殖數(shù)量最高的蝦類之一,然而,隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大,養(yǎng)殖對蝦的病害問題也逐漸嚴(yán)重,其中危害最為嚴(yán)重的是病毒和細(xì)菌,因此,研究對蝦的免疫防御機制,了解對蝦的免疫基礎(chǔ),對于對蝦的養(yǎng)殖具有重大的經(jīng)濟(jì)價值。本試驗依據(jù)同源物種的基因序列設(shè)計引物,結(jié)合RACE技術(shù)克隆得到了凡納濱對蝦的兩個纖維蛋白原相關(guān)蛋白基因(LvFREP1和LvFREP2)和一個B類清道夫受體Croquemort型基因(LvSRB-Croquemort)。通過生物信息學(xué)分析這幾個基因的結(jié)構(gòu)特點及其同源性,再利用半定量PCR(RT-PCR)檢測在鰓、肝胰腺、血淋巴、心臟、腸、肌肉、神經(jīng)組織等10個組織中的表達(dá)差異,用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測在注射鰻弧菌(Vibrio anguillarum,V.anguillarum)、溶壁微球菌(Micrococcus lysoleikticus,M.lysodeikticus)和白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)后不同時間點凡納濱對蝦這三個基因的時空表達(dá)規(guī)律。此外,對LvSRB-Croquemort進(jìn)行dsRNA干擾沉默后并注射哈維氏弧菌(Vibro harveyi,V.harveyi)檢測不同時間點相關(guān)基因的表達(dá)規(guī)律,對這些基因做了初步的研究,得到了以下試驗結(jié)果:(1)LvFREP1基因克隆得到的序列有三種,定義為LvFREP1-1、LvFREP1-2和LvFREP1-3。LvFREP1-1的基因長度為802bp,開放閱讀框為783bp,編碼260個氨基酸,LvFREP1-2的基因長度為1714bp,開放閱讀框為1689bp,編碼562個氨基酸;LvFREP1-3的基因長度為1593bp,開放閱讀框為1569bp,編碼522個氨基酸;LvFREP2基因序列長度為942bp,開放閱讀框長939bp,編碼312個氨基酸;LvSRB-Croquemort基因的編碼區(qū)長度為1602bp,編碼533個氨基酸。(2)系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示:這三種基因都與對應(yīng)基因的日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)的同源性最高,與其他物種同源性都相對較低。(3)組織表達(dá)分布結(jié)果顯示:LvFREP1基因只在鰓、血淋巴、腸、心臟和神經(jīng)組織中被檢測到,其中在鰓中表達(dá)量最高;LvFREP2基因在血淋巴和鰓中表達(dá)量較高,其他組織表達(dá)量較少或者不表達(dá);LvSRB-Croquemort基因在所有檢測到的組織中均有表達(dá),在血淋巴和精巢中表達(dá)量最高。(4)病原刺激的時序表達(dá)結(jié)果顯示:LvFREP1基因在鰻弧菌刺激組中,其表達(dá)量逐漸升高,在48h時有所下降,在溶壁微球菌組中,其表達(dá)量逐漸升高,并且隨后差異達(dá)到顯著和極顯著,在白斑綜合征病毒組中在24h有所上升;LvFREP2基因的鰻弧菌組中在6h時其表達(dá)量顯著高于對照組,12h時表達(dá)量開始降低,溶壁微球菌和白斑病毒刺激組在6h和48h均有表達(dá)高峰期;LvSRB-Croquemort基因,在鰻弧菌組中,其表達(dá)量在注射6h后達(dá)到最大,之后逐漸降,在溶壁微球菌組中,其表達(dá)量在48h才有比較明顯的上升;在白斑病毒組中,其表達(dá)量在先降低后上升。(5)用dsRNA干擾技術(shù)沉默LvSRB-Croquemort基因之后的結(jié)果顯示:對蝦的三種抗菌肽ALF,Crustin,Pen3的表達(dá)量在沉默該基因之后總體都有顯著下降的趨勢,而其兩個轉(zhuǎn)錄因子中,Dorsal沒有顯著變化,Relish的表達(dá)量先降低后升高。以上結(jié)果表明:LvFREP1,LvFREP2,LvSRB-Croquemort基因都可能參與著對蝦對抗病原體刺激的先天性免疫反應(yīng)過程。
【關(guān)鍵詞】：凡納濱對蝦 模式識別受體(PRRs) FREP1 FREP2 SRB-Croquemort
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-24
• 1.1 凡納濱對蝦的生物學(xué)信息12-13
• 1.2 凡納濱對蝦養(yǎng)殖病害防治現(xiàn)狀13-14
• 1.3 凡納濱對蝦免疫系統(tǒng)14-16
• 1.3.1 物理屏障14-15
• 1.3.2 體液免疫15
• 1.3.3 細(xì)胞免疫15-16
• 1.4 模式識別受體相關(guān)研究16-18
• 1.4.1 TLR16-17
• 1.4.2 CLR17
• 1.4.3 NLR17
• 1.4.4 RLR17-18
• 1.4.5 胞質(zhì)DNA識別分子18
• 1.5 對蝦免疫基因FREPS和SR-BS的研究進(jìn)展18-22
• 1.5.1 FREPs基因的研究進(jìn)展18-21
• 1.5.2 SR-Bs基因的研究進(jìn)展21-22
• 1.6 研究的目的和意義22-24
• 第二章 凡納濱對蝦LvFREP1基因克隆及表達(dá)分析24-39
• 2.1 試驗材料25-26
• 2.1.1 試驗動物25
• 2.1.2 試驗中所用的細(xì)菌和病毒25
• 2.1.3 主要試劑和試劑盒25
• 2.1.4 主要的儀器設(shè)備25-26
• 2.2 試驗方法26-30
• 2.2.1 引物設(shè)計與合成26
• 2.2.2 總RNA提取26
• 2.2.3 cDNA的合成26-27
• 2.2.4 FREP1部分目的片段的擴(kuò)增27
• 2.2.5 利用RACE技術(shù)獲得目的基因的編碼區(qū)27-28
• 2.2.6 FREP1基因的生物信息學(xué)分析28-29
• 2.2.7 FREP1基因在各組織表達(dá)分析29
• 2.2.8 FREP1基因在不同病原刺激后的時序表達(dá)29-30
• 2.3 結(jié)果與分析30-36
• 2.3.1 DNA產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果30
• 2.3.2 凡納濱對蝦FREP1基因生物信息分析30-35
• 2.3.3 FREP1基因在各組織內(nèi)的表達(dá)觀察35-36
• 2.3.4 FREP1基因?qū)Σ煌≡w刺激的時序表達(dá)36
• 2.4 討論36-38
• 2.5 小結(jié)38-39
• 第三章 凡納濱對蝦LvFREP2基因克隆及表達(dá)分析39-50
• 3.1 試驗材料40
• 3.2 試驗方法40-42
• 3.2.1 總RNA提取及cDNA合成40
• 3.2.2 引物設(shè)計與合成40
• 3.2.3 基因片段克隆40-41
• 3.2.4 電泳檢測41
• 3.2.5 目的片段回收41
• 3.2.6 連接轉(zhuǎn)化41
• 3.2.7 陽性克隆篩選41-42
• 3.2.8 LvFREP2基因的生物信息學(xué)分析42
• 3.2.9 LvFREP2基因?qū)Σ煌≡w的時序表達(dá)42
• 3.2.10 LvFREP2基因在各組織的表達(dá)42
• 3.3 結(jié)果與分析42-48
• 3.3.1 凡納濱對蝦引物檢測42-43
• 3.3.2 凡納濱對蝦目的片段回收43
• 3.3.3 克隆篩選結(jié)果43-44
• 3.3.4 LvFREP2基因序列分析44-45
• 3.3.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析45-47
• 3.3.6 LvFREP2基因?qū)Σ煌≡w刺激的時序表達(dá)47-48
• 3.3.7 LvFREP2基因在各組織中表達(dá)分析48
• 3.4 討論48-49
• 3.5 小結(jié)49-50
• 第四章 凡納濱對蝦LvSR-B Croquemort基因在免疫應(yīng)答中的相關(guān)研究50-62
• 4.1 試驗材料51
• 4.1.1 試驗動物51
• 4.1.2 試驗中所用到病原51
• 4.1.3 試驗儀器和試劑51
• 4.2 試驗方法51-55
• 4.2.1 總RNA的提取及第一條cDNA的合成51
• 4.2.2 引物設(shè)計與合成51-52
• 4.2.3 SR-B Croquemort基因部分片段的擴(kuò)增52-53
• 4.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測、回收及連接轉(zhuǎn)化53
• 4.2.5 通過RACE技術(shù)獲得目的基因的編碼區(qū)53
• 4.2.6 SR-B Croquemort基因的生物信息學(xué)分析53
• 4.2.7 SR-B Croquemort基因的組織表達(dá)53
• 4.2.8 SR-B Croquemort基因?qū)Σ煌≡w的時序表達(dá)53-54
• 4.2.9 SR-B Croquemort基因dsRNA的體外模板合成、轉(zhuǎn)錄純化及沉默該基因后相關(guān)基因的表達(dá)變化54-55
• 4.3 結(jié)果與分析55-60
• 4.3.1 LvSRB Croquemort基因的編碼區(qū)序列及其對應(yīng)的核酸序列55-56
• 4.3.2 LvSRB-Croquemort基因的多序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化分析56-58
• 4.3.3 LvSRB-Croquemort基因在各組織內(nèi)的表達(dá)觀察58
• 4.3.4 LvSRB-Croquemort基因?qū)Σ煌≡w刺激的時序表達(dá)58-59
• 4.3.5 LvSRB-Croquemort基因通過dsRNA沉默后相關(guān)基因的表達(dá)59-60
• 4.4 討論60-61
• 4.5 小結(jié)61-62
• 第五章 結(jié)論、創(chuàng)新點和展望62-63
• 結(jié)論62
• 創(chuàng)新點62
• 研究展望62-63
• 參考文獻(xiàn)63-70
• 附錄70-74
• 縮略詞74-75
• 致謝75-76
• 作者簡介76

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 林惠山;戚雋淵;喬燕平;;凡納濱對蝦高產(chǎn)養(yǎng)殖水質(zhì)優(yōu)化技術(shù)探討[J];水產(chǎn)科技情報;2006年04期

2 衣萌萌;于赫男;林小濤;許忠能;周小壯;;密度脅迫下凡納濱對蝦的行為與生理變化[J];暨南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版);2012年01期

3 周歧存,丁q，

本文編號：726967