本文關(guān)鍵詞：狂犬病病毒基因工程疫苗制備及基因治療載體的改造

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【摘要】：狂犬病毒是由彈狀病毒科狂犬病毒屬的成員,它是一種單股負(fù)鏈RNA病毒,其基因組主要編碼5種結(jié)構(gòu)蛋白,從3’端到5’端依次為核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、糖蛋白(G)和依賴RNA的RNA多聚酶(L)。其中,G蛋白不僅是唯一可以誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)產(chǎn)生中和抗體的抗原蛋白,還決定病毒的細(xì)胞嗜性和病毒吸附細(xì)胞的能力,從而使狂犬病毒具有強(qiáng)烈的神經(jīng)嗜性。狂犬病是狂犬病毒引起的一種人畜共患、急性、致死性的傳染病,機(jī)體一旦感染發(fā)病,死亡率100%。目前,尚無有效的治療方式,暴露前疫苗免疫是最好的預(yù)防措施。同時,由于狂犬病毒G蛋白在體外難以表達(dá)純化,所以G蛋白多克隆抗體和單克隆抗體難以制備。基于以上背景,本課題主要從以下3個方面進(jìn)行:1.狂犬病毒亞單位疫苗的制備根據(jù)G蛋白可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的特點(diǎn),使用具有安全性高,免疫原性低、表達(dá)持續(xù)時間長等優(yōu)點(diǎn)的腺相關(guān)病毒表達(dá)載體AAV病毒載體表達(dá)G蛋白,制備一種新型的亞單位疫苗。本課題選取了狂犬病毒疫苗株SADL16的G蛋白(包括第194、333位氨基酸突變和未突變類型)、、B2C株G蛋白及N2C株G蛋白作為表達(dá)對象。同時我們在表達(dá)載體中插入土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)以提高G蛋白表達(dá)量。質(zhì)粒構(gòu)建完成后在HEK-293T細(xì)胞系上包裝成能表達(dá)G蛋白的亞單位疫苗,經(jīng)過滴度測定、G蛋白表達(dá)檢測后,通過肌肉注射免疫6周齡雌性Balb/c小鼠,然后分別在免疫后第1、2、3、9月末檢測小鼠體內(nèi)中和抗體水平。結(jié)果表明,免疫組小鼠產(chǎn)生較高水平的中和抗體,且比疫苗對照組存在明顯的優(yōu)勢。為了檢測抗體是否可以在狂犬病毒感染后產(chǎn)生保護(hù)力,以50倍的狂犬病毒CVS-24株半數(shù)致死劑量進(jìn)行病毒感染實驗。攻毒實驗表明,該表達(dá)G蛋白的AAV亞單位疫苗可以為機(jī)體提供有效的保護(hù)力。與其他疫苗相比,該疫苗具有成本低、免疫程序簡單(只需一次免疫即可)、貯存和運(yùn)輸條件要求低(4℃)以及抗體水平持續(xù)時間長等優(yōu)點(diǎn)。2.G蛋白多克隆抗體的快速制備由于G蛋白在體外難以表達(dá)純化,可以利用表達(dá)G蛋白的AAV重組病毒免疫小鼠,然后收集其血清作為G蛋白的多克隆抗體。間接免疫熒光實驗結(jié)果也表明,可以利用此方法快速制備G蛋白的多克隆抗體。3.狂犬病毒作為基因治療載體的改造由于狂犬病毒具有嚴(yán)格的嗜神經(jīng)性,我們嘗試逐步改造狂犬病毒,提高其安全性,并最終作為神經(jīng)退行性疾病基因治療的轉(zhuǎn)移載體使用。首先,我們將BDNF、NGF插入缺失G蛋白的狂犬病毒基因組,然后在此基礎(chǔ)上再缺失狂犬病毒M蛋白和P蛋白。目前,狂犬病毒G蛋白缺失株已經(jīng)在B7GG細(xì)胞系拯救完成,后者由于沒有對應(yīng)的細(xì)胞系可以完成病毒的拯救,所以我們利用CRISPR技術(shù)在B7GG細(xì)胞系基礎(chǔ)上構(gòu)建同時表達(dá)M、P、G蛋白的細(xì)胞系。同時,本課題以AAV重組病毒過表達(dá)α-突觸核蛋白構(gòu)建帕金森綜合征(Parkinson’s disease,PD)疾病模型,目前已完成了前期的質(zhì)粒構(gòu)建及病毒包裝工作。目前沒有細(xì)胞系可以用于缺失M、P蛋白的狂犬病毒的拯救,所以我們B7GG細(xì)胞系的基礎(chǔ)上,利用CRISPR技術(shù)將狂犬病毒的M、P蛋白敲入B7GG細(xì)胞基因組,構(gòu)建同時表達(dá)狂犬病毒M、P、G蛋白的細(xì)胞系。在此過程,我們將B7GG細(xì)胞系中綠色熒光蛋白(GFP)替換為紅色熒光蛋白(m Cherry)以便于細(xì)胞篩選工作,同時將潮霉素基因也克隆到該細(xì)胞系利于細(xì)胞的抗性篩選。將重組目的基因片段與g RNA共轉(zhuǎn)染B7GG細(xì)胞后,經(jīng)過潮霉素和流式篩選,我們易獲得同時表達(dá)M、P、G蛋白的細(xì)胞系(B7CMPG)。
【關(guān)鍵詞】：狂犬病病毒 糖蛋白 腺相關(guān)病毒 疫苗 多克隆抗體 神經(jīng)嗜性 神經(jīng)退行性疾病 基因治療 細(xì)胞系構(gòu)建 CRISPR
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 縮略詞表（Abbreviation）10-12
• 第1章 文獻(xiàn)綜述12-18
• 引言12
• 1.1 狂犬病及其流行概述12
• 1.2 狂犬病毒研究進(jìn)展12-14
• 1.2.1 狂犬病毒的分類12-13
• 1.2.2 狂犬病毒結(jié)構(gòu)基因13-14
• 1.2.3 狂犬病毒的免疫原性和嗜神經(jīng)性14
• 1.3 狂犬病疫苗研究現(xiàn)狀14-15
• 1.3.1 狂犬病疫苗分類14-15
• 1.3.2 狂犬病疫苗研究進(jìn)展15
• 1.4 神經(jīng)退行性疾病概述15-16
• 1.5 基因治療研究進(jìn)展16
• 1.5.1 基因治療概述16
• 1.5.2 基因治療病毒性轉(zhuǎn)運(yùn)載體16
• 1.6 CRISPR-Cas系統(tǒng)與基因編輯16-18
• 第2章 目的與意義18-19
• 2.1 狂犬病重組AAV亞單位疫苗及G蛋白多克隆抗體的快速制備18
• 2.2 狂犬病毒作為神經(jīng)退行性疾病基因治療載體的初步探究18-19
• 第3章 狂犬病重組AAV亞單位疫苗及G蛋白多克隆抗體的快速制備19-48
• 3.1 試驗材料19-22
• 3.1.1 細(xì)胞、病毒、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件19
• 3.1.2 實驗動物19
• 3.1.3 實驗儀器及耗材19-20
• 3.1.4 主要的工具酶、抗體、試劑及標(biāo)準(zhǔn)血清20
• 3.1.5 主要培養(yǎng)基、抗生素及其配置20-21
• 3.1.6 緩沖液及其配置21-22
• 3.1.7 主要的生物學(xué)分析軟件22
• 3.2 試驗方法22-36
• 3.2.1 以氯化鈣法制備感受態(tài)細(xì)胞22
• 3.2.2 相關(guān)引物的設(shè)計及合成22-24
• 3.2.3 重組腺相關(guān)病毒感染性克隆的構(gòu)建24-30
• 3.2.4 rAAV病毒包裝30-31
• 3.2.5 rAAV滴度測定-間接免疫熒光試驗31-32
• 3.2.6 Western blot檢測G蛋白表達(dá)32-33
• 3.2.7 小鼠免疫實驗33-34
• 3.2.8 中和抗體水平檢測- FAVN法34-35
• 3.2.9 小鼠攻毒試驗（CVS-24）35
• 3.2.10 小鼠血清作為G蛋白多抗-免疫熒光檢測試驗35
• 3.2.11 腦內(nèi)病毒含量檢測35-36
• 3.3 結(jié)果和分析36-46
• 3.3.1 重組腺相關(guān)病毒(rAAV)感染性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定36-38
• 3.3.2 rAAV病毒包裝、滴度測定及G蛋白表達(dá)檢測38-40
• 3.3.3 中和抗體水平檢測40-42
• 3.3.4 疫苗免疫保護(hù)力檢測42-45
• 3.3.5 小鼠血清作為G蛋白多抗-免疫熒光檢測試驗45-46
• 3.4 討論46-47
• 3.4.1 AAV病毒的包裝及G蛋白表達(dá)檢測46
• 3.4.2 AAV疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生狂犬病毒中和抗體水平的檢測46-47
• 3.4.3 攻毒實驗結(jié)果分析47
• 3.4.4 快速制備狂犬病毒G蛋白多克隆抗體47
• 3.5 結(jié)論47-48
• 第4章 狂犬病毒作為神經(jīng)退行性疾病基因治療載體的初步探究48-66
• 4.1 實驗材料48-51
• 4.1.1 細(xì)胞、病毒、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件48
• 4.1.2 實驗動物48
• 4.1.3 實驗儀器及耗材48-49
• 4.1.4 主要的工具酶、抗體、試劑及標(biāo)準(zhǔn)血清49
• 4.1.5 主要培養(yǎng)基、抗生素及其配置49-50
• 4.1.6 緩沖液及其配置50
• 4.1.7 主要的生物學(xué)分析軟件50-51
• 4.2 實驗方法51-60
• 4.2.1 相關(guān)引物的設(shè)計及合成51-54
• 4.2.2 狂犬病病毒感染性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建54-56
• 4.2.3 穩(wěn)定表達(dá)狂犬病毒P、M、G蛋白細(xì)胞系的構(gòu)建56-59
• 4.2.4 狂犬病毒缺失株的拯救59-60
• 4.2.5 過表達(dá) α-突觸核蛋白進(jìn)行PD小鼠模型的構(gòu)建60
• 4.3 結(jié)果60-64
• 4.3.1 重組狂犬病毒感染性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建60-62
• 4.3.2 重組狂犬病毒缺失株的拯救62-63
• 4.3.3 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)狂犬病毒P、M、G蛋白細(xì)胞系63
• 4.3.4 PD小鼠模型的構(gòu)建63-64
• 4.4 討論64-65
• 4.4.1 狂犬病毒載體安全性64-65
• 4.4.2 穩(wěn)定表達(dá)狂犬病毒P、M、G蛋白細(xì)胞系的構(gòu)建65
• 4.5 結(jié)論65
• 4.6 后期工作65-66
• 參考文獻(xiàn)66-73
• 致謝73

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本文編號：713205