本文關(guān)鍵詞：低溫脅迫對黃姑魚生理生化指標和Hsp70基因表達模式的影響

  更多相關(guān)文章： 低溫脅迫 半致死溫度 SOD CAT Na~+/-K~+-ATP Hsp70 序列分析 表達分析

【摘要】：為了研究黃姑魚(Nibea albiflora)在低溫脅迫下行為表現(xiàn)、組織學、生理生化指標、以及相關(guān)耐寒基因表達的變化。通過實驗生態(tài)學方法確定黃姑魚的半致死低溫,并研究低溫脅迫對黃姑魚行為表現(xiàn)、組織學指標和相關(guān)生理生化指標的影響,進一步克隆分離了黃姑魚熱應(yīng)激蛋白70(Hsp70)基因核心序列并研究了其組織分布以及其在低溫脅迫下基因和蛋白水平的表達差異。研究結(jié)果如下:(1)以18℃為對照組,設(shè)置5.5℃、6.5℃、7.5℃和8.5℃三個低溫組,確定了黃姑魚幼魚12h對應(yīng)的半致死溫度并表征了極端低溫下黃姑魚組織及行為表現(xiàn)方面的變化。結(jié)果表明:水溫5.5℃和6.5℃條件下,實驗魚在短時間內(nèi)便出行為異常并分別在6h和9h內(nèi)全部死亡。水溫7.5℃條件下,實驗魚則在應(yīng)激反應(yīng)17min后有一個恢復(fù)身體平衡的過程,處理12h后半數(shù)實驗魚死亡;而8.5℃組和對照組則表現(xiàn)正常。因此確定了18℃馴養(yǎng)條件下黃姑魚12h對應(yīng)的半致死溫度為7.5℃。取對照組(18℃)和低溫處理組(7.5℃)魚肌肉和鰓進行組織學石蠟切片,并拍照觀察發(fā)現(xiàn)低溫脅迫能導致鰓絲腫大、血管堵塞、鰓小片出現(xiàn)水樣變質(zhì)、空泡性惡化、表皮細胞大量破損等一系列癥狀。而肌肉組織則出現(xiàn)肌纖維腫大、肌纖維間隙擴大,排列疏松等現(xiàn)象。說明極端低溫能造成黃姑魚組織的嚴重損傷。(2)以18℃為對照組,設(shè)置8℃、10℃和14℃三個低溫脅迫組,測定不同溫度急性脅迫對黃姑魚幼魚超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)以及Na~+/-K~+-ATP酶活力的影響。研究結(jié)果表明,低溫脅迫組(8℃、10℃和14℃)的SOD和CAT酶活力隨著脅迫溫度的降低及其脅迫時間的延長呈先升高后降低的趨勢,在72h時恢復(fù)到對照組水平。肌肉中的Na~+/-K~+-ATP酶活力則隨處理時間的延長呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢,10℃和14℃組能夠在72h時恢復(fù)到對照組水平,而8℃組則在72h仍顯著低于對照組。由此說明,SOD、CAT以及Na~+/-K~+-ATP參與了黃姑魚低溫脅迫應(yīng)答過程,可以作為其低溫脅迫應(yīng)答的標志物。(3)采用RT-PCR的方法分離克隆出了黃姑魚Hsp70基因cDNA核心序列,共2143bp,包括5’非編碼區(qū)128bp、編碼區(qū)1917bp以及3’非編碼區(qū)98bp,同源性分析表明,黃姑魚Hsp70氨基酸序列與大黃魚、浉魚等動物相似性高達99%。通過半定量RT-PCR的方法檢測其在黃姑魚肝臟、鰓、脾臟和肌肉等組織中的表達差異,結(jié)果表明,Hsp70 mRNA在黃姑魚四種組織中均有表達,且各組織中表達量有所差異:肌肉和鰓絲中表達量高,其次是脾臟,肝臟最少。應(yīng)用Real Time-PCR技術(shù)研究低溫(10℃)脅迫對黃姑魚肌肉中Hsp70 mRNA表達的影響。結(jié)果表明,低溫脅迫下黃姑魚肌肉Hsp70 mRNA水平呈先升高后降低的變化趨勢,說明該基因的表達受低溫應(yīng)激調(diào)控。對低溫脅迫下黃姑魚肌肉Hsp70蛋白含量表達差異研究表明,低溫脅迫下黃姑魚肌肉的Hsp70蛋白含量隨著處理時間的延長呈先升高后降低趨勢,10℃和14℃組能夠在72h時恢復(fù)到對照組水平,而8℃組則在72h仍顯著高于對照組。
【關(guān)鍵詞】：低溫脅迫 半致死溫度 SOD CAT Na~+/-K~+-ATP Hsp70 序列分析 表達分析
【學位授予單位】：浙江海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4
【目錄】：

• 摘要8-10
• ABSTRACT10-15
• 第一章 緒論15-21
• 1.1 水溫與魚類的關(guān)系15
• 1.2 低溫脅迫對魚類的影響15-19
• 1.2.1 研究魚類低溫脅迫的意義15
• 1.2.2 魚類致死低溫的研究進展15-16
• 1.2.3 魚類應(yīng)對低溫刺激的反應(yīng)16-18
• 1.2.4 魚類Hsp70的研究進展18-19
• 1.3 本研究的主要目的與意義19-21
• 第二章 黃姑魚半致死低溫的研究及低溫脅迫對黃姑魚行為表現(xiàn)和組織學指標的影響21-26
• 2.1 材料和方法21-22
• 2.1.1 實驗材料21
• 2.1.2 實驗方法21-22
• 2.2 結(jié)果與分析22-24
• 2.2.1 行為表現(xiàn)及半致死溫度22-23
• 2.2.2 組織學變化23-24
• 2.3 討論24-25
• 2.4 小結(jié)25-26
• 第三章 低溫脅迫對黃姑魚相關(guān)生理生化指標的影響26-32
• 3.1 材料與方法26-27
• 3.1.1 實驗材料26
• 3.1.2 實驗方法26-27
• 3.1.3 數(shù)據(jù)分析27
• 3.2 結(jié)果27-30
• 3.2.1 不同溫度處理的黃姑魚組織的SOD酶活力比較27-28
• 3.2.2 不同溫度處理的黃姑魚組織中CAT酶活力比較28-30
• 3.2.3 不同溫度處理黃姑魚的肌肉中Na~+/-K~+-ATP酶活力比較30
• 3.3 討論30-31
• 3.3.1 低溫脅迫對黃姑魚抗氧化酶活性的影響30-31
• 3.3.2 低溫脅迫對黃姑魚肌肉中Na~+/-K~+-ATPase活力的影響31
• 3.4 小結(jié)31-32
• 第四章 黃姑魚耐低溫相關(guān)基因Hsp70在低溫脅迫前后的表達差異32-50
• 4.1 材料與方法32-40
• 4.1.1 材料32-34
• 4.1.2 實驗流程34-35
• 4.1.3 基因克隆35-39
• 4.1.4 組織間差異表達分析39
• 4.1.5 低溫脅迫下差異表達分析39-40
• 4.2 結(jié)果與分析40-46
• 4.2.1 總RNA的提取40-41
• 4.2.2 黃姑魚Hsp70 cDNA核心序列41-42
• 4.2.3 序列分析及同源性比較42-44
• 4.2.4 蛋白結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測44-45
• 4.2.5 黃姑魚Hsp70基因的組織表達差異45
• 4.2.6 黃姑魚Hsp70基因在低溫脅迫下差異表達分析45-46
• 4.2.7 不同溫度處理的黃姑魚肌肉中Hsp70蛋白含量比較46
• 4.3 討論46-49
• 4.3.1 黃姑魚Hsp70 cDNA的分離及其序列分析46-47
• 4.3.2 黃姑魚Hsp70 cDNA的空間表達47-48
• 4.3.3 低溫脅迫對黃姑魚Hsp70基因和蛋白表達水平的影響48-49
• 4.4 小結(jié)49-50
• 主要研究結(jié)論50-51
• 參考文獻51-59
• 致謝59-60
• 在讀期間發(fā)表的學術(shù)論文及研究成果60

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