本文關(guān)鍵詞：VIGS技術(shù)高通量篩選棉花抗黃萎病相關(guān)基因

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【摘要】：棉花黃萎病是由黃萎病菌引起的一種土傳真菌維管束病害，嚴(yán)重危害棉花的生產(chǎn)，被稱為“棉花的癌癥”。棉花黃萎病危害嚴(yán)重，難以防控，很大程度上歸咎于抗黃萎病抗源的缺乏，及對棉花抗黃萎病分子機(jī)理研究的欠缺，再加上生產(chǎn)上缺少行之有效的防控技術(shù)和措施。從基因水平上揭示棉花抗黃萎病的特征和機(jī)制，依然是揭示棉花抗黃萎病分子機(jī)理，提高棉花對黃萎病抗性的基礎(chǔ)工作。然而長期以來，因受到研究材料的限制，以及研究手段的欠缺，從基因水平上去研究和探索棉花抗黃萎病分子機(jī)理難度很大。病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)（virus induced gene silencing，VIGS）是利用反向遺傳學(xué)策略揭示植物基因功能的重要技術(shù)之一，，為從基因水平上揭示棉花抗黃萎病的分子機(jī)制提供了新的契機(jī)。 本研究以中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所棉花病害組選育的陸地棉(Gossypiumhirsutum)抗黃萎病品系——中植棉KV3為材料，在實(shí)驗(yàn)室前期抑制差減雜交和基因芯片分析的基礎(chǔ)上，初步挑選出106個可能與棉花抗黃萎病相關(guān)的基因，并用病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)（virus induced gene silencing，VIGS）研究這些基因在棉花抗黃萎病中的作用和功能。所利用的VIGS載體為棉葉皺縮病毒（Cotton leaf crumple virus,CLCrV）改造�？偣渤晒�(gòu)建了6大類，62個VIGS基因載體。所構(gòu)建的載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌后，用農(nóng)桿菌侵染法進(jìn)行基因沉默實(shí)驗(yàn)，靶向性沉默相對應(yīng)的基因，然后用傷根法接種黃萎病菌，檢測基因沉默棉花植株對棉花黃萎病抗性的變化情況。由此，利用VIGS這一反向遺傳學(xué)的技術(shù)高通量地篩選出棉花抗黃萎病相關(guān)基因，為棉花抗黃萎病機(jī)制的研究，以及棉花抗病品種分子選育提供基礎(chǔ)性工作。主要研究結(jié)果如下： 1.利用CLCrV誘導(dǎo)的基因沉默體系，靶向性沉默葉綠素合成相關(guān)基因CHLI和CLA1，基因沉默后植株的葉片表現(xiàn)出明顯的黃化和白化表型；還確認(rèn)了目的基因沉默植株中，目的基因的表達(dá)量也明顯降低；且空載體轉(zhuǎn)化對照植株與野生型植株對黃萎病菌的抗性無明顯差異；說明該體系在中植棉KV3中可沉默目的基因，用于目的基因功能的研究； 2.運(yùn)用VIGS技術(shù)高通量篩選棉花抗黃萎病相關(guān)基因，三輪重復(fù)試驗(yàn)篩選出8個與棉花抗、感黃萎病相關(guān)的基因。其中6個基因[Gh39（bZIP）、Gh24（GRAS）、Gh58（WRKY）、Gh55（EIN2）、Gh114（XTH）、Gh97（Drigent-like protein）]正調(diào)控棉花對黃萎病的抗性，2個基因[Gh15（bZIP）、Gh31（NAC5）]負(fù)調(diào)控棉花對黃萎病的抗性； 3.對其中的3個基因進(jìn)行功能注釋與表達(dá)特性分析。結(jié)果顯示：Gh55為乙烯信號途徑中的正向調(diào)控因子EIN2，利用VIGS技術(shù)沉默該基因，沉默植株接種黃萎病菌后，病癥明顯加重，說明該基因是一棉花黃萎病的正調(diào)控基因；沉默Gh97（Dirigent-like protein）的植株接種黃萎病菌后，癥狀顯著加重，聚類分析結(jié)果顯示該基因?qū)儆贒IRb/d家族，且在根部的表達(dá)量很高，這些結(jié)果說明，Gh97可能在根部介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生木質(zhì)化，從而阻止了黃萎病菌的入侵及繁殖，提高了棉花對黃萎病菌的抗性；Gh114是一種木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶(XTH)，沉默該基因的植株對黃萎病菌更敏感，表明該基因可能通過改變植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，參與棉花對黃萎病菌的抗性。
【關(guān)鍵詞】：棉花黃萎病 VIGS 高通量篩選 抗性相關(guān)基因
【學(xué)位授予單位】：山西師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S562
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 英文縮略表9-13
• 1 緒論13-25
• 1.1 棉花黃萎病13-20
• 1.1.1 棉花黃萎病的危害13
• 1.1.2 棉花黃萎病菌的生物學(xué)特性13-14
• 1.1.3 棉花黃萎病菌的侵染過程及致病機(jī)理14-16
• 1.1.4 棉花的抗病機(jī)理16-20
• 1.2 病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silence）20-22
• 1.2.1 VIGS 的機(jī)制20-21
• 1.2.2 VIGS 技術(shù)的建立、發(fā)展及運(yùn)用21-22
• 1.2.3 VIGS 技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)及局限性22
• 1.3 本研究的目的與意義22-25
• 2 材料與方法25-37
• 2.1 材料與儀器25-26
• 2.1.1 材料25
• 2.1.2 試劑與儀器25-26
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法26-37
• 2.2.1 棉花材料的培養(yǎng)26
• 2.2.2 病原菌培養(yǎng)及接種方法26
• 2.2.3 VIGS 載體的構(gòu)建26-33
• 2.2.4 農(nóng)桿菌浸染的 VIGS 接種方法33
• 2.2.5 熒光定量 PCR 檢測目的基因表達(dá)量33-35
• 2.2.6 沉默植株抗病性檢測35-36
• 2.2.7 組織特異性檢測36-37
• 3 結(jié)果與分析37-55
• 3.1 基因的挑選37
• 3.2 VIGS 載體的構(gòu)建37-41
• 3.2.1 構(gòu)建 VIGS 載體37-39
• 3.2.2 成功構(gòu)建的 VIGS 載體39-41
• 3.3 陽性對照基因驗(yàn)證 VIGS 沉默體系41-42
• 3.4 qPCR 檢測目的基因的沉默效率42-43
• 3.5 利用 VIGS 技術(shù)高通量篩選棉花抗黃萎病相關(guān)基因43-44
• 3.6 接菌后表型及癥狀44-47
• 3.7 部分抗病相關(guān)基因功能注釋及表達(dá)特征分析47-55
• 3.7.1 乙烯相關(guān)基因47-50
• 3.7.2 抗病相關(guān)基因50-52
• 3.7.3 細(xì)胞壁重構(gòu)相關(guān)基因52-55
• 4 討論55-57
• 5 結(jié)論57-59
• 致謝59-61
• 參考文獻(xiàn)61-71
• 附錄 A71-74
• 附件 B74-81
• 附錄 C：攻讀碩士期間發(fā)表的論文81

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李鳳瑞;史加亮;楊秀鳳;;棉花抗黃萎病研究進(jìn)展及前景展望[J];山東農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年09期

2 朱荷琴,宋曉軒,刑金松,郭金城;棉花的抗氧化系統(tǒng)與其抗黃萎病的關(guān)系[J];華北農(nóng)學(xué)報;1995年S1期

3 劉西劍,陳長永;湖北省棉花黃萎病菌菌系致病力測定[J];華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;1989年03期

4 姚明鏡，張獻(xiàn)龍，劉金蘭，孫濟(jì)中;陸地棉抗黃萎病細(xì)胞系幾個生理生化指標(biāo)的測定[J];華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;1995年04期

5 ;Virus-induced gene silencing and its application in plant functional genomics[J];Science China(Life Sciences);2012年02期

6 黃昌軍;錢亞娟;李正和;周雪平;;病毒誘導(dǎo)的基因沉默及其在植物功能基因組研究中的應(yīng)用[J];中國科學(xué):生命科學(xué);2012年01期

7 顧本康,李經(jīng)儀,陸迅,顧萍;江蘇棉花Verticillium dahliae Kleb.生物學(xué)和致病性研究[J];江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報;1988年04期

8 涂禮莉;張獻(xiàn)龍;劉迪秋;金雙俠;曹景林;朱龍付;鄧鋒林;譚家福;張存斌;;棉花纖維發(fā)育和體細(xì)胞胚發(fā)生過程中實(shí)時定量PCR內(nèi)對照基因的篩選[J];科學(xué)通報;2007年20期

9 吳獻(xiàn)忠;;棉花黃萎病菌致病機(jī)理的初步研究[J];萊陽農(nóng)學(xué)院學(xué)報;1992年03期

10 王杰;郭金城;李為;;河南省棉花黃萎病菌致病力測定初報[J];棉花學(xué)報;1993年01期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 陳捷胤;海島棉LRR-TM類抗病基因GbaVd1和GbaVd2的克隆與功能研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2010年

本文編號：711989