本文關鍵詞：SLC7A5基因在腫瘤細胞中的表達調控研究

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【摘要】：氨基酸是構成蛋白質的基本元件,同時參與細胞內許多重要的代謝途徑,氨基酸的轉運異常會導致嚴重的氨基酸吸收和代謝障礙性疾病,因此氨基酸的轉運具有重要的病理學意義。在哺乳動物中,氨基酸的跨膜運輸是由多種氨基酸轉運載體蛋白所介導,原因在于氨基酸屬于小分子極性物質,不能自由通過細胞膜,必須由細胞膜上相應的氨基酸轉運蛋白協(xié)助。在腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲過程中同樣也需要大量的氨基酸提供營養(yǎng),而氨基酸轉運蛋白為腫瘤細胞氨基酸的進出提供了載體通道,所以氨基酸轉運蛋白在腫瘤發(fā)生及進展中具有關鍵性作用,其調控機制研究一直是腫瘤領域的熱點問題。L型氨基酸轉運載體1(L-type amino acid transporter 1,LAT1),又稱為SLC7A5,為L型氨基酸轉運載體中的重要成員,主要負責轉運大的、支鏈的、芳香族的中性氨基酸,包括一些必需氨基酸。已有文獻表明,SLC7A5在一些腫瘤組織(如膠質瘤)中異常高表達,但是對其具體的生物學功能則研究較少,鑒于SLC7A5的研究將對今后醫(yī)學、營養(yǎng)學等生命科學研究具有重要意義,故本文就該氨基酸轉運載體蛋白的表達、調節(jié)及其相關研究作進一步的探討。本課題主要由三部分組成：1:SLC7A5基因的GEO數據庫組織表達譜分析我們利用NCBI-GEO數據庫分析了SLC7A5基因在小鼠和人源的不同正常組織中的表達豐度。發(fā)現該基因在小鼠和人的大腦、睪丸、卵巢、胎盤等正常組織中高表達,而在肺、心、肝臟等組織中表達量較少,結果顯示SLC7A5基因在這兩個物種中的表達具有組織特異性,同時又具有物種之間表達的相似性。利用該數據庫我們還分析了SLC7A5在人不同腫瘤組織中的表達情況,結果表明,與正常組織相比,SLC7A5基因在腫瘤組織中普遍高表達,提示其可能發(fā)揮促癌作用。2:SLC7A5基因在腫瘤細胞中的生物學效應分析以人源非小細胞肺癌細胞系H1299和人源乳腺癌細胞系MCF-7為研究材料,通過RT-PCR實驗,初步明確了SLC7A5基因在這兩個細胞系中的表達水平。成功構建了含SLC7A5基因ORF區(qū)域的重組質粒pcDNA3.1-SLC7A5,在上述兩個細胞系中轉染該質粒,通過MTT及流式細胞實驗檢測了SLC7A5基因對細胞增殖能力和細胞周期的影響。結果顯示SLC7A5可以促進H1299細胞和MCF-7細胞的增殖,且大部分細胞處于DNA復制的S期,。以上結果說明SLC7A5基因在腫瘤細胞中發(fā)揮促進細胞增殖的作用。最后,通過在H1299和MCF-7細胞中過表達pcDNA3.1-SLC7A5,結合RT-PCR實驗,從分子層面探討了SLC7A5基因對細胞周期相關基因的調控。結果表明,在H1299細胞中,SLC7A5可以促進cyclinA1、cyclinE1的表達,而對其他基因的表達無顯著影響；在MCF-7細胞中,SLC7A5可以促進cyclinD1、cyclinE1的表達,對其他基因的表達無顯著影響。3:SLC7A5基因在腫瘤細胞中的轉錄調控分析利用生物信息學軟件分析SLC7A5的啟動子區(qū)域,發(fā)現該區(qū)域有一個轉錄起始位點(TSS),以及多個轉錄因子結合區(qū)域,其中包括smad、p53的結合位點,提示SLC7A5可能與TGF-β/Smads信號通路或p53的調控相關。我們構建了含SLC7A5啟動子區(qū)域的質粒pGL3-SLC7A5 promoter,將它同Renilla質粒共轉染到H1299、MCF-7細胞中,通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證SLC7A5基因在這兩個細胞中的轉錄水平。結果發(fā)現,SLC7A5在H1299細胞中的啟動子活性高于MCF-7細胞。由于MCF-7細胞中含有野生型p53基因,而H1299為p53缺失型細胞,我們推測p53會對SLC7A5基因起調控作用。由此,我們進一步探討了野生型p53及突變型p53對SLC7A5基因的調控作用。在H1299和MCF-7細胞中分別轉染pcDNA3.1-mut p53(H175)、pcDNA3.1-mut p53(W248)、pcDNA3.1-wt p53、pcDNA3.1質粒,通過RT-PCR實驗,證實了突變型p53可以促進SLC7A5的表達,而野生型p53可以在一定程度上抑制SLC7A5的表達。此外,將外源TGF-β1、TGF-β3分別作用于H1299和MCF-7細胞,通過RT-PCR實驗,證實了在H1299細胞中,SLC7A5的表達水平隨著TGF-β1、TGF-β3濃度的增高而增高；對于MCF-7細胞,在5ng/ml的TGF-β1、TGF-β3濃度下,SLC7A5的表達水平最高,但在10ng/ml的條件下,SLC7A5的表達量有所下降。結果表明SLC7A5可以響應TGF-β1/3的刺激,但其表達水平因細胞類型的不同而有所不同。綜上,本論文明確了SLC7A5基因在腫瘤中發(fā)揮促癌作用；確定了SLC7A5基因可以通過上調細胞周期相關基因的表達,從而促進細胞的增殖；TGF-β1/3和p53參與調控SLC7A5基因的表達,具體體現在TGF-β1/3在一定程度上促進SLC7A5基因的表達,而野生型p53抑制SLC7A5,突變型p53可以促進SLC7A5的表達。
【關鍵詞】：SLC7A5 促癌作用 細胞增殖 TGF-β p53
【學位授予單位】：湖南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R730.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 主要縮略詞表13-14
• 第一章 緒論14-23
• 1.1 腫瘤概況14-15
• 1.2 氨基酸轉運蛋白與腫瘤發(fā)生15-17
• 1.2.1 氨基酸轉運蛋白簡介15-16
• 1.2.2 氨基酸轉運蛋白SLC7A5與腫瘤發(fā)生16-17
• 1.3 細胞周期蛋白與腫瘤發(fā)生17
• 1.4 轉錄因子p53與腫瘤發(fā)生17-20
• 1.5 TGF-β/Smads信號通路與腫瘤發(fā)生20-21
• 1.6 論文研究思路21-23
• 第二章 SLC7A5基因的GEO組織表達譜分析23-26
• 2.1 前言23
• 2.2 方法23
• 2.2.1 實驗方法23
• 2.3 結果與討論23-25
• 2.3.1 SLC7A5在小鼠正常組織中的GEO組織表達譜分析24
• 2.3.2 SLC7A5在人正常組織和相應的腫瘤組織中的GEO組織表達譜分析24-25
• 2.4 本章小結25-26
• 第三章 SLC7A5基因在腫瘤細胞中的生物學效應分析26-42
• 3.1 前言26
• 3.2 材料與方法26-36
• 3.2.1 儀器26
• 3.2.2 材料26-27
• 3.2.3 實驗方法27-36
• 3.3 結果與討論36-40
• 3.3.1 分析SLC7A5在H1299和MCF-7細胞系中的表達情況36
• 3.3.2 SLC7A5基因重組表達質粒的構建36-37
• 3.3.3 SLC7A5對H1299和MCF-7細胞增殖的影響37-38
• 3.3.4 SLC7A5對H1299和MCF-7細胞周期的影響38-39
• 3.3.5 SLC7A5對細胞周期相關基因表達的影響39-40
• 3.4 本章小結40-42
• 第四章 SLC7A5在腫瘤細胞中的轉錄調控分析42-58
• 4.1 前言42
• 4.2 材料與方法42-49
• 4.2.1 儀器42-43
• 4.2.2 材料43-44
• 4.2.3 實驗方法44-49
• 4.3 結果與討論49-56
• 4.3.1 生物信息學方法分析SLC7A5的啟動子區(qū)域49
• 4.3.2 SLC7A5啟動子在腫瘤細胞中的轉錄活性分析49-51
• 4.3.3 不同的p53基因對腫瘤細胞中SLC7A5表達調控的影響51-54
• 4.3.4 TGF-β1/3對腫瘤細胞中SLC7A5表達調控的影響54-56
• 4.4 本章小結56-58
• 結論58-59
• 參考文獻59-66
• 附錄A 攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文66-67
• 致謝67

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5 趙W，

本文編號：658619