本文關(guān)鍵詞：cPLA2α基因敲除小鼠的構(gòu)建、繁殖與鑒定

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【摘要】：目的:c PLA2α能夠高選擇性地水解膜磷脂,起始花生四烯酸和溶血磷脂級(jí)聯(lián)反應(yīng),釋放一系列炎癥因子,促進(jìn)炎癥反應(yīng)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),c PLA2α在乳腺癌和肝癌患者組織中高表達(dá),并且c PLA2α在乳腺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲,肝癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中具有重要作用。為了系統(tǒng)性地研究c PLA2α在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,我們利用先進(jìn)的TALEN技術(shù)構(gòu)建了c PLA2α基因敲除小鼠模型,繁殖得到基因敲除純合子,并對(duì)其進(jìn)行一系列的鑒定,最后通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)c PLA2α在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的作用。方法:1.分析c PLA2α基因序列,設(shè)計(jì)TALEN打靶載體,利用PCR與Golden Gate法組裝TALEN載體;2.將TALEN載體體外轉(zhuǎn)錄的m RNA注射入小鼠受精卵中,經(jīng)母鼠代孕及與野生型雜交后獲得TALEN敲除F0及F1代小鼠;3.利用F1代基因敲除雜合子小鼠進(jìn)行大規(guī)模的飼養(yǎng)繁殖;4.提取幼鼠腳趾DNA,經(jīng)PCR與測(cè)序后鑒定幼鼠基因型,得到c PLA2α基因敲除純合子小鼠;5.提取基因敲除純合子、雜合子及野生型小鼠組織蛋白,Western Blotting檢測(cè)c PLA2α蛋白表達(dá)水平,驗(yàn)證基因敲除效果;6.收集三種基因型小鼠的代謝物,進(jìn)行UPLC/Q-TOF-MS后分析代謝組學(xué)數(shù)據(jù),尋找組間差異較大的代謝物;7.構(gòu)建小鼠Lewis肺癌模型,證實(shí)c PLA2α在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中的作用;DEN誘導(dǎo)小鼠肝癌模型,研究c PLA2α在肝癌發(fā)生中的作用。結(jié)果:1.選取c PLA2α基因中的外顯子3作為TALEN靶標(biāo),成功構(gòu)建了TALEN-L和TALEN-R載體;2.顯微注射后得到3只陽性F0代小鼠,與野生型雜交后得到共7只F1代雜合子小鼠,分別缺失三種片段;3.利用4只F1代雜合子,經(jīng)過8個(gè)月的飼養(yǎng)繁殖,總計(jì)生產(chǎn)34次,獲得226只幼鼠;4.對(duì)每只小鼠標(biāo)記及鑒定后,共得到c PLA2α基因敲除純合子小鼠36只;5.c PLA2α敲除純合子小鼠組織中,c PLA2α蛋白不表達(dá),c PLA2α敲除雜合子小鼠c PLA2α蛋白表達(dá)水平比野生型低;6.代謝組學(xué)結(jié)果顯示,花生四烯酸、溶血磷脂酸、前列腺素、白三烯、血栓素等代謝物在組間差異較大,可以將野生組與雜合組、純合組的樣本進(jìn)行很好的區(qū)分;7.Lewis肺癌模型證實(shí),c PLA2α敲除對(duì)腫瘤的生長無明顯影響,但幾乎完全抑制了腫瘤的肝轉(zhuǎn)移;DEN在野生型和c PLA2α敲除小鼠中均成功誘導(dǎo)了肝癌。結(jié)論:1.利用TALEN技術(shù)成功構(gòu)建了c PLA2α基因敲除小鼠,得到F1代基因敲除雜合子;2.繁殖得到了c PLA2α基因敲除純合子小鼠,為后續(xù)研究c PLA2α與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系提供了重要的動(dòng)物模型;3.從基因水平和蛋白水平兩個(gè)方面對(duì)基因敲除純合子小鼠進(jìn)行了鑒定與驗(yàn)證;4.代謝組學(xué)分析了c PLA2α基因敲除所引起的代謝物改變,間接證實(shí)了基因敲除模型構(gòu)建的成功,也為更深入的研究c PLA2α的生理功能提供了更多潛在標(biāo)志物;5.c PLA2α基因敲除可顯著抑制腫瘤的體內(nèi)轉(zhuǎn)移;成功構(gòu)建了DEN肝癌誘導(dǎo)模型。
【關(guān)鍵詞】：cPLA2α 基因敲除 TALEN 純合子 鑒定 代謝組學(xué)
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語10-12
• 前言12-16
• 研究現(xiàn)狀、成果12-14
• 研究目的、方法14-16
• 對(duì)象和方法16-29
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料16-20
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物16
• 1.1.2 常用試劑耗材16-17
• 1.1.3 主要試劑及溶液的配置17-19
• 1.1.4 主要儀器設(shè)備19-20
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法20-29
• 1.2.1 TALEN載體的構(gòu)建20-21
• 1.2.2 顯微注射及F0、F1代小鼠鑒定21
• 1.2.3 基因敲除小鼠的飼養(yǎng)與繁殖21-22
• 1.2.4 小鼠基因型鑒定22-24
• 1.2.5 小鼠c PLA2α蛋白表達(dá)水平鑒定24-26
• 1.2.6 代謝組學(xué)分析26-28
• 1.2.7 Lewis肺癌模型驗(yàn)證c PLA2α敲除對(duì)腫瘤體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響28
• 1.2.8 小鼠DEN誘導(dǎo)肝癌模型的建立28-29
• 結(jié)果29-42
• 2.1 TALEN載體構(gòu)建29-30
• 2.2 顯微注射F0及F1代小鼠情況30-32
• 2.3 小鼠繁殖生長情況32-33
• 2.4 小鼠基因型鑒定33-34
• 2.5 小鼠cPLA2α蛋白表達(dá)水平檢測(cè)34-35
• 2.6 UPLC-QTOF質(zhì)譜35
• 2.7 代謝組學(xué)分析35-39
• 2.8 lewis肺癌模型中cLPA2α敲除對(duì)腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的影響39-40
• 2.9 小鼠DEN誘導(dǎo)肝癌模型的建立40-42
• 討論42-47
• 3.1 c PLA2α在腫瘤中的作用研究42-43
• 3.2 TALEN技術(shù)構(gòu)建基因敲除小鼠的優(yōu)勢(shì)與限制43-44
• 3.3 基因敲除小鼠飼養(yǎng)繁殖中的問題44
• 3.4 代謝組學(xué)分析44-45
• 3.5 c PLA2α基因敲除小鼠的應(yīng)用前景45-47
• 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-53
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明53-54
• 附錄54-60
• 綜述 基因敲除技術(shù)的研究進(jìn)展60-78
• 綜述參考文獻(xiàn)72-78
• 致謝78-79
• 個(gè)人簡歷79

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本文編號(hào)：623081