本文關(guān)鍵詞：熱泉菌Bacillus sp.BI-19產(chǎn)耐高溫脂肪酶的基因克隆及其酶學性質(zhì)研究

  更多相關(guān)文章： 嗜熱微生物 脂肪酶 基因克隆 異源表達 酶學性質(zhì)

【摘要】：熱泉是耐高溫脂肪酶的一個重要來源,它具有獨特的生境環(huán)境,為嗜熱微生物提供了良好的生存環(huán)境,耐高溫脂肪酶具有良好的熱穩(wěn)定性、較高的反應(yīng)速率等特點。耐高溫的脂肪酶在生物催化上具有其他常溫脂肪酶不可比擬的優(yōu)點,特別是在洗滌行業(yè)具有較好的發(fā)展前景。因此,研究熱泉微生物和其產(chǎn)生的耐高溫脂肪酶具有重要的理論意義和生產(chǎn)前景。本課題以印度洋卡利安達島東海岸熱泉樣品為材料,通過樣品稀釋、平板劃線、羅丹明B平板檢測等方法,根據(jù)單菌落在羅丹明B平板上的透明圈直徑大小,獲得一株高產(chǎn)脂肪酶菌株BI-19；通過16S rRNA鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育分析,發(fā)現(xiàn)其和Bacillus. sp親緣關(guān)系較近,所以初步鑒定為芽孢桿菌屬,并命名為Bacillus.sp BI-19。為提高Bacillus. sp BI-19的酶活,首先進行了培養(yǎng)條件優(yōu)化,分別以不同培養(yǎng)pH、不同接種量、不同碳源、不同碳源濃度、不同氮源、不同氮源濃度、不同金屬離子、不同的三丁酸甘油酯濃度和不同裝液量作為唯一變量進行單因素實驗。根據(jù)單因素的結(jié)果利用minitab軟件設(shè)計PB實驗,篩選出的對脂肪酶活性影響較為顯著的三個影響因子(硫酸銨、KCl、三丁酸甘油酯),根據(jù)這三個影響因子設(shè)計最陡爬坡實驗,最后利用Design-Expert軟件設(shè)計響應(yīng)面并分析,最終得到當硫酸銨的質(zhì)量分數(shù)為0.65%,三丁酸甘油酯的濃度為0.03%,KCl的濃度為5.57mmol/L時,Bacillus. sp BI-19酶活最高,可達50.5U/ml,是優(yōu)化前的2倍。為實現(xiàn)Bacillus.sp BI-19產(chǎn)脂肪酶的高效異源表達,我們首先通過構(gòu)建基因組DNA質(zhì)粒文庫的方法篩選獲得了兩個脂肪酶編碼基因的完整開放閱讀框(ORF),分別命名為lip-0256和lip-1954。然后利用基因工程手段將脂肪酶基因lip-0256和lip-1954分別連接到表達載體pET-30(a+)中,并成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21(DE3).兩株重組菌破碎細胞上清酶活測定表明,重組酶Lip-1954酶活較Lip-0256高,且Lip-1954的可溶性表達可達50%,因此本論文以重組菌pET-30(a+)-lip-1954作為后續(xù)的研究菌株。為研究重組酶Lip-1954的酶學性質(zhì),首先對重組酶Lip-1954進行純化。因表達載體pET-30(a+)上具有His標簽,所以本研究采用鎳離子親和層析對Lip1954進行分離純化。純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測顯示為較單一條帶,在30KD左右,大小與預(yù)測一致。純化后的Lip-1954的酶學性質(zhì)研究表明,Lip-1954重組酶的最適反應(yīng)溫度為70℃,而且該酶在60～75℃時酶活還保持在50%左右的酶活；其最適pH為9,說明該酶屬于堿性脂肪酶,在洗滌劑領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用；在反應(yīng)體系中加入Cu2+、Cd2+、Sr2+、Mg2+、Na+、Fe3+、K+、Ca2+、Fe2+、Pb2+,其中Na+、Fe3+、Cd2+、K+、Fe2+對Lipase-1954具有促進作用,其中Fe3+的促進作用最為顯著達到200%,而Cu2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、pb2+對Lip-1954具有抑制作用。重組酶Lip-1954對有機溶劑的耐受性研究結(jié)果表明,該酶對丙三醇(甘油)和正丁醇的耐受性較好,且對其催化活性具有促進作用,特備是在加入正丁醇的反應(yīng)體系中,其酶活是未加有機溶劑的兩倍；而在反應(yīng)體系中加入甲醇、乙醇、三氯甲烷、石油醚、正己烷,其酶活也能保持在60%以上,表明Lip-1954對有機溶劑具有較好的耐受性。
【關(guān)鍵詞】：嗜熱微生物 脂肪酶 基因克隆 異源表達 酶學性質(zhì)
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;Q936
【目錄】：

• 中文摘要12-14
• ABSTRACT14-16
• 第一章 前言16-22
• 1.1 脂肪酶的簡介16-20
• 1.1.1 脂肪酶的來源16-17
• 1.1.2 脂肪酶的結(jié)構(gòu)和催化機理17-18
• 1.1.3 脂肪酶的研究現(xiàn)狀18-19
• 1.1.4 脂肪酶的應(yīng)用19-20
• 1.2 耐高溫脂肪酶20-22
• 1.2.1 本論文耐高溫脂肪酶的來源20-21
• 1.2.2 耐高溫脂肪酶的研究現(xiàn)狀21-22
• 1.3 本課題的研究目的和意義22
• 第二章 產(chǎn)耐高溫脂肪酶菌株的篩選和鑒定22-28
• 2.1 實驗材料23-24
• 2.1.1 材料和試劑23
• 2.1.2 培養(yǎng)基23-24
• 2.2 實驗方法24-25
• 2.2.1 初篩24
• 2.2.2 復(fù)篩24
• 2.2.3 脂肪酶酶活的測定24-25
• 2.2.4 基因組DNA的提取25
• 2.2.5 16S rRNA基因的PCR擴增25
• 2.2.6 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建25
• 2.3 實驗結(jié)果與分析25-28
• 2.3.1 初篩與復(fù)篩25-26
• 2.3.2 菌株BI-19號菌的種屬鑒定26-28
• 2.4 小結(jié)與討論28
• 第三章 Bacillus sp.BI-19菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化28-41
• 3.1 實驗材料28-29
• 3.1.1 菌株29
• 3.1.2 試劑29
• 3.2 試驗方法29-36
• 3.2.1 制備種子液29
• 3.2.2 標準曲線的制備29-30
• 3.2.3 菌株的生物量和酶活曲線30
• 3.2.4 單因素實驗30-32
• 3.2.5 設(shè)計Plackett-Burman實驗32-33
• 3.2.6 最陡爬坡實驗33-34
• 3.2.7 Box-Behnken設(shè)計及結(jié)果34-36
• 3.3 實驗結(jié)果與分析36-40
• 3.3.1 BI-19號菌株的生長曲線和產(chǎn)酶曲線36-37
• 3.3.2 單因素實驗結(jié)果37-39
• 3.3.3 響應(yīng)面分析結(jié)果39-40
• 3.4 實驗小結(jié)與討論40-41
• 第四章 Bacillus sp.B1-19菌株基因組DNA質(zhì)粒文庫的構(gòu)建與耐高溫脂肪酶基因的克隆41-47
• 4.1 實驗材料41-42
• 4.1.1 菌株與常用軟件41
• 4.1.2 實驗試劑41-42
• 4.2 實驗方法42-43
• 4.2.1 基因組DNA提取42
• 4.2.2 基因組DNA質(zhì)粒文庫的構(gòu)建42
• 4.2.3 產(chǎn)高溫脂肪酶基因克隆的篩選42
• 4.2.4 高溫脂肪酶的基因序列分析42-43
• 4.3 實驗結(jié)果與分析43-47
• 4.3.1 基因組DNA的提取43
• 4.3.2 菌落PCR檢測和測序驗證43-44
• 4.3.3 陽性克隆的篩選44
• 4.3.4 脂肪酶基因的序列分析44-47
• 4.4 實驗小結(jié)與討論47
• 第五章 脂肪酶基因lip-1954和lip-0256的異源表達47-55
• 5.1 實驗材料與方法48-49
• 5.1.1 實驗菌株48
• 5.1.2 實驗儀器48
• 5.1.3 實驗試劑48-49
• 5.2 試驗方法49-51
• 5.2.1 基因組DNA的提取49
• 5.2.2 設(shè)計引物并引物PCR49
• 5.2.3 瓊脂糖凝膠回收49
• 5.2.4 連接pMD18-T simple載體49-50
• 5.2.5 質(zhì)粒提取和PCR檢測50
• 5.2.6 雙酶切和瓊脂糖凝膠回收50
• 5.2.7 連接到表達載體pET-30(a+)并PCR檢測50
• 5.2.8 轉(zhuǎn)化入T0P10并測序50-51
• 5.2.9 提取TOP10的質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化入BL21中51
• 5.2.10 耐高溫脂肪酶的誘導(dǎo)表達51
• 5.3 實驗結(jié)果與分析51-54
• 5.3.1 基因組DNA提取和引物PCR51-52
• 5.3.2 重組酶的誘導(dǎo)表達結(jié)果52-54
• 5.4 實驗小結(jié)和討論54-55
• 第六章 重組酶Lip-1954的酶學性質(zhì)研究55-61
• 6.1 實驗材料55
• 6.1.1 菌株與儀器55
• 6.1.2 主要試劑55
• 6.2 實驗方法55-57
• 6.2.1 目的蛋白的分離純化56
• 6.2.2 重組酶的酶學性質(zhì)研究56-57
• 6.3 實驗結(jié)果與分析57-60
• 6.3.1 蛋白純化57-58
• 6.3.2 酶學性質(zhì)研究58-60
• 6.4 實驗小結(jié)與討論60-61
• 第七章 總結(jié)和展望61-63
• 參考文獻63-73
• 致謝73-74
• 碩士期間發(fā)表文章74-75
• 附件75

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 尹海濱;王婷;鄭萍;;真菌細胞溶壁酶的分離純化及其酶學性質(zhì)研究[J];廣州化工;2010年07期

2 趙冠杰;楊志強;郭養(yǎng)浩;;枇杷核醇腈酶的高效分離純化及酶學性質(zhì)研究[J];福州大學學報(自然科學版);2011年02期

3 于宏偉;栗志丹;郝珊珊;賈英民;;蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選及酶學性質(zhì)研究[J];農(nóng)產(chǎn)品加工(學刊);2006年10期

4 夏俊剛;何逵夫;謝希賢;徐慶陽;陳寧;;枯草芽孢桿菌嘌呤核苷磷酸化酶酶學性質(zhì)研究及在利巴韋林酶法合成中的應(yīng)用[J];中國生物工程雜志;2010年12期

5 陳靜;邢巖;周皓芹;佟金;陳玉香;;一株產(chǎn)乙酰酯酶細菌篩選、鑒定及酶學性質(zhì)研究[J];微生物學通報;2012年06期

6 陜婧婧;竇文芳;李會;張旦旦;許泓瑜;陳敬華;許正宏;;硫酸乙酰肝素3-O硫酸基轉(zhuǎn)移酶5的表達、純化及酶學性質(zhì)研究[J];生物技術(shù)通報;2012年08期

7 羅鏊琳;陳彩芳;張洋;葉秀云;;一種木聚糖酶的分離及其酶學性質(zhì)研究[J];科技資訊;2006年14期

8 盧嬋;鄭璞;孫志浩;;L-谷氨酸氧化酶的克隆表達、純化及酶學性質(zhì)研究[J];中國生物工程雜志;2013年06期

9 王曉紅;茆軍;傅力;顧美英;王偉;段繼華;;低溫淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選及酶學性質(zhì)研究[J];農(nóng)產(chǎn)品加工(學刊);2007年01期

10 胡長浩;施文芳;沈麟;林琳;;脂肪酶菌種的篩選、鑒定及酶學性質(zhì)研究[J];生物技術(shù);2009年02期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 湯鳴強;謝必峰;吳松剛;;復(fù)合酶制劑中果膠酶不同組分的分離純化及其酶學性質(zhì)研究[A];2004年全國生物技術(shù)學術(shù)研討會論文集[C];2004年

2 湯鳴強;謝必峰;吳松剛;;復(fù)合酶制劑中果膠酶不同組分的分離純化及其酶學性質(zhì)研究[A];2004年全國生物技術(shù)學術(shù)研討會論文集[C];2004年

3 包怡紅;李雪龍;;類芽孢桿菌木聚糖酶產(chǎn)生菌株的篩選及其酶學性質(zhì)研究[A];中國食品科學技術(shù)學會第五屆年會暨第四屆東西方食品業(yè)高層論壇論文摘要集[C];2007年

4 陳昭;田元勇;朱蓓薇;;魷魚肝臟蛋白酶的酶學性質(zhì)研究[A];中國食品科學技術(shù)學會第八屆年會暨第六屆東西方食品業(yè)高層論壇論文摘要集[C];2011年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 劉波;紅曲霉生淀粉酶發(fā)酵優(yōu)化、分離純化及其酶學性質(zhì)研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學;2014年

2 黃平;沉積微桿菌TPS/TPP基因的克隆、表達及酶學性質(zhì)研究[D];福建農(nóng)林大學;2016年

3 林小洪;產(chǎn)木聚糖酶海洋微生物的選育及酶學性質(zhì)研究[D];福州大學;2014年

4 劉秀萌;熱泉菌Bacillus sp.BI-19產(chǎn)耐高溫脂肪酶的基因克隆及其酶學性質(zhì)研究[D];山東大學;2016年

5 盛嘉元;脂環(huán)酸芽孢桿菌產(chǎn)耐酸耐高溫淀粉酶及酶學性質(zhì)研究[D];南京理工大學;2009年

6 韓萍;低溫淀粉酶的分離、純化及其酶學性質(zhì)研究[D];昆明理工大學;2007年

7 趙獻春;產(chǎn)脫枝酶菌株的篩選酶的分離純化及酶學性質(zhì)研究[D];江南大學;2009年

8 劉爽;耐冷菌Pseudomonas sp.W7產(chǎn)低溫蛋白酶的分離純化及酶學性質(zhì)研究[D];黑龍江大學;2012年

9 黃加保;芥藍抗壞血酸過氧化物酶在大腸桿菌中的基因表達及酶學性質(zhì)研究[D];江南大學;2013年

10 封勝雪;兩種新型嗜熱酯酶的克隆、表達及酶學性質(zhì)研究[D];鄭州輕工業(yè)學院;2013年

，

本文編號：622940