本文關(guān)鍵詞：合浦珠母貝幾丁質(zhì)酶基因與章魚胺受體基因的克隆、表達與功能分析

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【摘要】：合浦珠母貝(Pinctada fucata),是我國海水珍珠養(yǎng)殖的主要貝類,著名“南珠”即為其所產(chǎn)。近年來,由于養(yǎng)殖環(huán)境惡化、疾病蟲害以及種質(zhì)退化等原因?qū)е潞掀种槟肛愓渲楫a(chǎn)量及質(zhì)量下降。幾丁質(zhì)是貝殼形成的的三大重要成分之一,而幾丁質(zhì)酶又是幾丁質(zhì)的調(diào)控蛋白。章魚胺受體廣泛存在于無脊椎動物中,具有調(diào)節(jié)神經(jīng)肌源性節(jié)奏收縮、調(diào)節(jié)cAMP水平、參與磷酸化途徑等多種重要功能。為探究幾丁質(zhì)酶基因與章魚胺受體基因在合浦珠母貝生長發(fā)育及貝殼形成過程中的作用,本研究根據(jù)合浦珠母貝的高通量測序獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),克隆了合浦珠母貝幾丁質(zhì)酶-1基因與章魚胺受體基因,并通過不同組織的表達分析、不同發(fā)育時期的表達分析、破殼誘導(dǎo)表達分析和原位雜交實驗推測了這兩個基因的表達特性及生理功能。初步探討了它們在合浦珠母貝生長、發(fā)育以及貝殼修復(fù)過程中的作用,為進一步開展合浦珠母貝的繁育與育珠工作提供了理論基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:1.合浦珠母貝Pf-Chi1基因的克隆與表達分析本研究根據(jù)合浦珠母貝的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選到一個幾丁質(zhì)酶基因片段,通過5’-RACE和3’-RACE技術(shù)得到了合浦珠母貝幾丁質(zhì)酶-1基因的cDNA全長,命名為Pf-Chi1(GenBank登錄號:KT956975)。Pf-Chi1基因cDNA序列全長為2743bp,5'非翻譯區(qū)(5'-UTR)為47bp,開放閱讀框為2187bp,3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)為509bp,具有一個加尾信號(AATAAA)。該基因編碼728個氨基酸,蛋白的預(yù)測分子量為78.41kDa,理論等電點(PI)為5.57,包含一個長度為19個氨基酸的信號肽。功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白具有4個保守結(jié)構(gòu)域:1個N端催化結(jié)構(gòu)域(GH18糖水解結(jié)構(gòu)域)和3個幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBM14結(jié)構(gòu)域);幾丁質(zhì)酶-1氨基酸序列比對結(jié)果顯示,Pf-Chi1與其他物種Chi1具有同源性,相似度為22.43-31.4%,其中與太平洋牡蠣的相似性最高為31.4%;系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示,Pf-Chi1歸類于雙殼綱且與太平洋牡蠣Chi1聚為一支,說明Pf-Chi1屬于雙殼綱Chi1家族。實時熒光定量pcr(qrt-pcr)分析結(jié)果顯示,pf-chi1mrna在合浦珠母貝的外套膜、閉殼肌、鰓、肝胰腺、血液、腸和性腺中均有表達,并且在外套膜中的表達量最高,在腸中表達量最低。在合浦珠母貝幼蟲不同發(fā)育時期的表達分析結(jié)果顯示,pf-chi1mrna在擔輪期、d型期、殼頂期、眼點期和變態(tài)期5個時期中均有表達,且在擔輪期幼蟲的表達量極顯著的高于其他4個時期。上述結(jié)果表明pf-chi1基因可能在合浦珠母貝的生長發(fā)育、貝殼形成和幼蟲的變態(tài)發(fā)育階段起著重要作用。利用實時熒光定量pcr技術(shù)檢測pf-chi1基因在破殼后0h、6h、12h、24h、36h和48h6個不同時間段在外套膜中的表達情況。破殼誘導(dǎo)表達qrt-pcr分析結(jié)果顯示,pf-chi1mrna的表達量在破殼后先逐漸降低,在24h時顯著增加(p0.05),隨后逐漸降低到正常水平。上述結(jié)果表明,pf-chi1基因可能在合浦珠母貝貝殼的生長與修復(fù)過程中起重要作用。外套膜組織原位雜交實驗結(jié)果顯示,pf-chi1基因在外套膜邊緣內(nèi)褶的外表皮細胞有較強的雜交信號出現(xiàn),內(nèi)褶的內(nèi)表皮細胞與中褶的內(nèi)表皮細胞有少量雜交信號出現(xiàn),陰性對照沒有雜交信號出現(xiàn)。以上結(jié)果表明pf-chi1基因可能在合浦珠母貝的貝殼形成與修復(fù)過程中起重要的作用。2.合浦珠母貝pfoar基因的克隆與表達分析本研究克隆獲得了合浦珠母貝章魚胺受體基因的cdna全長,命名為pfoar(genbank登錄號:kx082720)。pfoar基因cdna序列全長為1890bp,5'非翻譯區(qū)(5'-utr)為113bp,開放閱讀框為1659bp,3'非翻譯區(qū)(3'-utr)為118bp。該基因編碼552個氨基酸,蛋白的預(yù)測分子量為63.167kda,理論等電點(pi)為9.19。功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白具有7個跨膜結(jié)構(gòu)域,具有g(shù)蛋白偶聯(lián)受體的共性。氨基酸序列比對結(jié)果顯示,pfoar與其他物種oar蛋白具有較高的同源性;系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示,pfoar與太平洋牡蠣oar聚為一支。qrt-pcr檢測結(jié)果顯示,pfoarmrna在合浦珠母貝的外套膜、珍珠囊、腸、肝胰腺、鰓和閉殼肌中均有表達,并且在外套膜中的表達量最高。在合浦珠母貝幼蟲不同發(fā)育時期的表達分析結(jié)果顯示,pfoarmrna在擔輪期、d型期、殼頂期、眼點期和變態(tài)期5個時期中均有表達,且在變態(tài)期幼蟲的表達量顯著的高于其他4個時期。上述結(jié)果表明pfoar基因可能在合浦珠母貝的生長發(fā)育、貝殼形成和幼蟲的變態(tài)發(fā)育階段起重要作用。利用qrt-pcr技術(shù)檢測pfoar基因在破殼后0h、6h、12h、24h、36h和48h6個不同時間段在外套膜中的表達情況。破殼誘導(dǎo)表達qrt-pcr的分析結(jié)果顯示,pfoarmrna的表達量在破殼后的第36h顯著升高(p0.05)。上述結(jié)果表明,pfoar基因可能在合浦珠母貝貝殼的生長與修復(fù)過程中起重要作用。
【關(guān)鍵詞】：合浦珠母貝 幾丁質(zhì)酶基因 章魚胺受體基因 實時熒光定量PCR 破殼誘導(dǎo)表達 原位雜交
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-13
• 引言13-14
• 第一章 文獻綜述14-21
• 1.1 合浦珠母貝研究概況14-17
• 1.1.1 合浦珠母貝簡介14
• 1.1.2 合浦珠母貝的貝殼結(jié)構(gòu)14-15
• 1.1.3 合浦珠母貝的礦化器官——外套膜15-16
• 1.1.4 合浦珠母貝的研究現(xiàn)狀16-17
• 1.2 幾丁質(zhì)和幾丁質(zhì)酶的研究概況17-18
• 1.2.1 幾丁質(zhì)簡介及研究概況17
• 1.2.2 幾丁質(zhì)酶簡介及研究概況17-18
• 1.3 章魚胺及章魚胺受體的研究概況18-19
• 1.4 本研究的目的、意義和技術(shù)路線19-21
• 1.4.1 研究目的19
• 1.4.2 研究意義19-20
• 1.4.3 技術(shù)路線20-21
• 第二章 合浦珠母貝Pf-Chi1基因與PfOAR基因的克隆及分子特征21-46
• 2.1 材料與方法21-34
• 2.1.1 實驗材料21
• 2.1.2 實驗試劑與耗材21-22
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備22-23
• 2.1.4 主要溶液、培養(yǎng)基及緩沖液的配制23
• 2.1.5 合浦珠母貝外套膜總RNA提取23-24
• 2.1.6 引物設(shè)計與合成24-25
• 2.1.7 cDNA全長的克隆25-33
• 2.1.8 生物信息學分析33-34
• 2.2 結(jié)果與分析34-44
• 2.2.1 合浦珠母貝外套膜總RNA的提取34
• 2.2.2 合浦珠母貝Pf-Chi1基因的克隆及分子特征34-40
• 2.2.3 合浦珠母貝PfOAR基因的克隆及分子特征40-44
• 2.3 討論44-46
• 2.3.1 合浦珠母貝Pf-Chi1基因44-45
• 2.3.2 合浦珠母貝PfOAR基因45-46
• 第三章 合浦珠母貝Pf-Chi1基因與PfOAR基因的表達分析及功能研究46-61
• 3.1 材料與方法46-50
• 3.1.1 實驗材料46-47
• 3.1.2 主要工具和試劑47
• 3.1.3 不同組織以及不同發(fā)育時期的實時熒光定量PCR表達分析47-48
• 3.1.4 合浦珠母貝Pf-Chi1基因與PfOAR基因的破殼誘導(dǎo)表達48-49
• 3.1.5 原位雜交49-50
• 3.2 結(jié)果與分析50-58
• 3.2.1 合浦珠母貝Pf-Chi1基因與PfOAR基因在不同組織和不同發(fā)育時期的熒光定量表達分析50-53
• 3.2.2 合浦珠母貝Pf-Chi1基因與PfOAR基因破殼后熒光定量表達分析53-55
• 3.2.3 合浦珠母貝Pf-Chi1基因原位雜交結(jié)果分析55-58
• 3.3 討論58-61
• 第四章 結(jié)論61-63
• 參考文獻63-70
• 附錄1 縮略詞表70-71
• 附錄2 碩士期間發(fā)表的文章和參加的會議71-72
• 致謝72

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本文編號：611176