本文關(guān)鍵詞：合浦珠母貝幾丁質(zhì)酶基因與章魚胺受體基因的克隆、表達(dá)與功能分析

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【摘要】：合浦珠母貝(Pinctada fucata),是我國海水珍珠養(yǎng)殖的主要貝類,著名“南珠”即為其所產(chǎn)。近年來,由于養(yǎng)殖環(huán)境惡化、疾病蟲害以及種質(zhì)退化等原因?qū)е潞掀种槟肛愓渲楫a(chǎn)量及質(zhì)量下降。幾丁質(zhì)是貝殼形成的的三大重要成分之一,而幾丁質(zhì)酶又是幾丁質(zhì)的調(diào)控蛋白。章魚胺受體廣泛存在于無脊椎動物中,具有調(diào)節(jié)神經(jīng)肌源性節(jié)奏收縮、調(diào)節(jié)cAMP水平、參與磷酸化途徑等多種重要功能。為探究幾丁質(zhì)酶基因與章魚胺受體基因在合浦珠母貝生長發(fā)育及貝殼形成過程中的作用,本研究根據(jù)合浦珠母貝的高通量測序獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),克隆了合浦珠母貝幾丁質(zhì)酶-1基因與章魚胺受體基因,并通過不同組織的表達(dá)分析、不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析、破殼誘導(dǎo)表達(dá)分析和原位雜交實(shí)驗(yàn)推測了這兩個(gè)基因的表達(dá)特性及生理功能。初步探討了它們在合浦珠母貝生長、發(fā)育以及貝殼修復(fù)過程中的作用,為進(jìn)一步開展合浦珠母貝的繁育與育珠工作提供了理論基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:1.合浦珠母貝Pf-Chi1基因的克隆與表達(dá)分析本研究根據(jù)合浦珠母貝的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選到一個(gè)幾丁質(zhì)酶基因片段,通過5’-RACE和3’-RACE技術(shù)得到了合浦珠母貝幾丁質(zhì)酶-1基因的cDNA全長,命名為Pf-Chi1(GenBank登錄號:KT956975)。Pf-Chi1基因cDNA序列全長為2743bp,5'非翻譯區(qū)(5'-UTR)為47bp,開放閱讀框?yàn)?187bp,3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)為509bp,具有一個(gè)加尾信號(AATAAA)。該基因編碼728個(gè)氨基酸,蛋白的預(yù)測分子量為78.41kDa,理論等電點(diǎn)(PI)為5.57,包含一個(gè)長度為19個(gè)氨基酸的信號肽。功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白具有4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域:1個(gè)N端催化結(jié)構(gòu)域(GH18糖水解結(jié)構(gòu)域)和3個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBM14結(jié)構(gòu)域);幾丁質(zhì)酶-1氨基酸序列比對結(jié)果顯示,Pf-Chi1與其他物種Chi1具有同源性,相似度為22.43-31.4%,其中與太平洋牡蠣的相似性最高為31.4%;系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示,Pf-Chi1歸類于雙殼綱且與太平洋牡蠣Chi1聚為一支,說明Pf-Chi1屬于雙殼綱Chi1家族。實(shí)時(shí)熒光定量pcr(qrt-pcr)分析結(jié)果顯示,pf-chi1mrna在合浦珠母貝的外套膜、閉殼肌、鰓、肝胰腺、血液、腸和性腺中均有表達(dá),并且在外套膜中的表達(dá)量最高,在腸中表達(dá)量最低。在合浦珠母貝幼蟲不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析結(jié)果顯示,pf-chi1mrna在擔(dān)輪期、d型期、殼頂期、眼點(diǎn)期和變態(tài)期5個(gè)時(shí)期中均有表達(dá),且在擔(dān)輪期幼蟲的表達(dá)量極顯著的高于其他4個(gè)時(shí)期。上述結(jié)果表明pf-chi1基因可能在合浦珠母貝的生長發(fā)育、貝殼形成和幼蟲的變態(tài)發(fā)育階段起著重要作用。利用實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)檢測pf-chi1基因在破殼后0h、6h、12h、24h、36h和48h6個(gè)不同時(shí)間段在外套膜中的表達(dá)情況。破殼誘導(dǎo)表達(dá)qrt-pcr分析結(jié)果顯示,pf-chi1mrna的表達(dá)量在破殼后先逐漸降低,在24h時(shí)顯著增加(p0.05),隨后逐漸降低到正常水平。上述結(jié)果表明,pf-chi1基因可能在合浦珠母貝貝殼的生長與修復(fù)過程中起重要作用。外套膜組織原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,pf-chi1基因在外套膜邊緣內(nèi)褶的外表皮細(xì)胞有較強(qiáng)的雜交信號出現(xiàn),內(nèi)褶的內(nèi)表皮細(xì)胞與中褶的內(nèi)表皮細(xì)胞有少量雜交信號出現(xiàn),陰性對照沒有雜交信號出現(xiàn)。以上結(jié)果表明pf-chi1基因可能在合浦珠母貝的貝殼形成與修復(fù)過程中起重要的作用。2.合浦珠母貝pfoar基因的克隆與表達(dá)分析本研究克隆獲得了合浦珠母貝章魚胺受體基因的cdna全長,命名為pfoar(genbank登錄號:kx082720)。pfoar基因cdna序列全長為1890bp,5'非翻譯區(qū)(5'-utr)為113bp,開放閱讀框?yàn)?659bp,3'非翻譯區(qū)(3'-utr)為118bp。該基因編碼552個(gè)氨基酸,蛋白的預(yù)測分子量為63.167kda,理論等電點(diǎn)(pi)為9.19。功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,具有g(shù)蛋白偶聯(lián)受體的共性。氨基酸序列比對結(jié)果顯示,pfoar與其他物種oar蛋白具有較高的同源性;系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示,pfoar與太平洋牡蠣oar聚為一支。qrt-pcr檢測結(jié)果顯示,pfoarmrna在合浦珠母貝的外套膜、珍珠囊、腸、肝胰腺、鰓和閉殼肌中均有表達(dá),并且在外套膜中的表達(dá)量最高。在合浦珠母貝幼蟲不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析結(jié)果顯示,pfoarmrna在擔(dān)輪期、d型期、殼頂期、眼點(diǎn)期和變態(tài)期5個(gè)時(shí)期中均有表達(dá),且在變態(tài)期幼蟲的表達(dá)量顯著的高于其他4個(gè)時(shí)期。上述結(jié)果表明pfoar基因可能在合浦珠母貝的生長發(fā)育、貝殼形成和幼蟲的變態(tài)發(fā)育階段起重要作用。利用qrt-pcr技術(shù)檢測pfoar基因在破殼后0h、6h、12h、24h、36h和48h6個(gè)不同時(shí)間段在外套膜中的表達(dá)情況。破殼誘導(dǎo)表達(dá)qrt-pcr的分析結(jié)果顯示,pfoarmrna的表達(dá)量在破殼后的第36h顯著升高(p0.05)。上述結(jié)果表明,pfoar基因可能在合浦珠母貝貝殼的生長與修復(fù)過程中起重要作用。
【關(guān)鍵詞】：合浦珠母貝 幾丁質(zhì)酶基因 章魚胺受體基因 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 破殼誘導(dǎo)表達(dá) 原位雜交
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-13
• 引言13-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-21
• 1.1 合浦珠母貝研究概況14-17
• 1.1.1 合浦珠母貝簡介14
• 1.1.2 合浦珠母貝的貝殼結(jié)構(gòu)14-15
• 1.1.3 合浦珠母貝的礦化器官——外套膜15-16
• 1.1.4 合浦珠母貝的研究現(xiàn)狀16-17
• 1.2 幾丁質(zhì)和幾丁質(zhì)酶的研究概況17-18
• 1.2.1 幾丁質(zhì)簡介及研究概況17
• 1.2.2 幾丁質(zhì)酶簡介及研究概況17-18
• 1.3 章魚胺及章魚胺受體的研究概況18-19
• 1.4 本研究的目的、意義和技術(shù)路線19-21
• 1.4.1 研究目的19
• 1.4.2 研究意義19-20
• 1.4.3 技術(shù)路線20-21
• 第二章 合浦珠母貝Pf-Chi1基因與PfOAR基因的克隆及分子特征21-46
• 2.1 材料與方法21-34
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料21
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與耗材21-22
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備22-23
• 2.1.4 主要溶液、培養(yǎng)基及緩沖液的配制23
• 2.1.5 合浦珠母貝外套膜總RNA提取23-24
• 2.1.6 引物設(shè)計(jì)與合成24-25
• 2.1.7 cDNA全長的克隆25-33
• 2.1.8 生物信息學(xué)分析33-34
• 2.2 結(jié)果與分析34-44
• 2.2.1 合浦珠母貝外套膜總RNA的提取34
• 2.2.2 合浦珠母貝Pf-Chi1基因的克隆及分子特征34-40
• 2.2.3 合浦珠母貝PfOAR基因的克隆及分子特征40-44
• 2.3 討論44-46
• 2.3.1 合浦珠母貝Pf-Chi1基因44-45
• 2.3.2 合浦珠母貝PfOAR基因45-46
• 第三章 合浦珠母貝Pf-Chi1基因與PfOAR基因的表達(dá)分析及功能研究46-61
• 3.1 材料與方法46-50
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料46-47
• 3.1.2 主要工具和試劑47
• 3.1.3 不同組織以及不同發(fā)育時(shí)期的實(shí)時(shí)熒光定量PCR表達(dá)分析47-48
• 3.1.4 合浦珠母貝Pf-Chi1基因與PfOAR基因的破殼誘導(dǎo)表達(dá)48-49
• 3.1.5 原位雜交49-50
• 3.2 結(jié)果與分析50-58
• 3.2.1 合浦珠母貝Pf-Chi1基因與PfOAR基因在不同組織和不同發(fā)育時(shí)期的熒光定量表達(dá)分析50-53
• 3.2.2 合浦珠母貝Pf-Chi1基因與PfOAR基因破殼后熒光定量表達(dá)分析53-55
• 3.2.3 合浦珠母貝Pf-Chi1基因原位雜交結(jié)果分析55-58
• 3.3 討論58-61
• 第四章 結(jié)論61-63
• 參考文獻(xiàn)63-70
• 附錄1 縮略詞表70-71
• 附錄2 碩士期間發(fā)表的文章和參加的會議71-72
• 致謝72

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