發(fā)布時(shí)間：2017-08-02 20:31

  本文關(guān)鍵詞：漢坦病毒Hunan03株S基因克隆、表達(dá)及核蛋白免疫原性分析

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【摘要】：目的構(gòu)建漢坦病毒Hunan03株核蛋白基因原核重組表達(dá)載體,在大腸桿菌中進(jìn)行核蛋白表達(dá),研究核蛋白的免疫性及免疫反應(yīng)性。方法設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增漢坦病毒Hunan03株S基因完整開放閱讀框(ORF)的引物,RT-PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物克隆到pGM-T載體,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞TOP10,應(yīng)用藍(lán)白斑篩選、酶切、PCR鑒定,定向克隆到pGEX-6p-2原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化Ecoli.BL21StarTM(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE、Western blot對(duì)重組蛋白進(jìn)行鑒定。應(yīng)用Glutathione Sepharose 4B純化柱純化重組蛋白,免疫新西蘭兔,建立間接ELISA法對(duì)核蛋白的免疫原性與免疫反應(yīng)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果 PCR擴(kuò)增S基因ORF區(qū)域產(chǎn)物大小約1 306bp,重組載體pGEX-6p-2-S經(jīng)雙酶切、PCR、測(cè)序鑒定提示構(gòu)建成功;在37℃,IPTG濃度為0.8mmol/L誘導(dǎo)5h的條件下,表達(dá)出最高量的相對(duì)分子量約74kDa的GST-NP融合蛋白。建立的間接ELISA法檢測(cè)GST-NP融合蛋白免疫后的新西蘭兔血清,IgM抗體滴度達(dá)1∶8 000,IgG抗體滴度達(dá)1∶16 000。結(jié)論成功構(gòu)建了高效表達(dá)的漢坦病毒S基因重組表達(dá)載體,獲得了純度較高具有較好的免疫原性與免疫反應(yīng)性的核蛋白,為后續(xù)漢坦病毒單克隆抗體的制備奠定了基礎(chǔ)。
【作者單位】： 湖南省疾病預(yù)防控制中心 湖南省微生物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;
【關(guān)鍵詞】： 漢坦病毒 S基因 原核表達(dá) 核蛋白免疫原性
【基金】：湖南省科技廳科研基金(No.2013TT2016)資助~~
【分類號(hào)】：R373
【正文快照】： 湖南省科技廳科研基金(No.2013TT2016)資助(1.Hunan Provincial Center for Disease Control and Prevention,the Key Laboratory of Microbial Molecular Biology of Hunan Province,Changsha410005,China;2.School of Basic Medical Science,Central South University,Chang，

本文編號(hào)：611121