本文關(guān)鍵詞：HFHG45基因?qū)ρ号c血管標志基因表達的影響

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【摘要】：哺乳動物生命周期較長,其基因完全敲除經(jīng)常導致胚胎死亡,不利于對心血管系統(tǒng)的研究和觀察。斑馬魚體形小,可以通過滲透作用提供氧氣和營養(yǎng),即使心血管有嚴重的缺陷也能存活一段時間。其胚胎發(fā)育時期透明,方便檢測和觀察,斑馬魚的心臟發(fā)育過程在進化上和人類具有高度的保守性,所以是學者們認可的研究心臟和心血管發(fā)育的理想的模式生物之一。本實驗室前期發(fā)現(xiàn)HFHG45調(diào)控血液與血管的發(fā)育。本文利用模式生物斑馬魚進一步研究HFHG45基因?qū)υ煅到y(tǒng)發(fā)育的影響。據(jù)報道,心腦血管發(fā)病人數(shù)居我國重大疾病之首,而且是我國死亡率最多的疾病。人類很多疾病的發(fā)生和發(fā)展都與血管或血液發(fā)育有著非常緊密和不可分割的聯(lián)系。脊椎動物中血管與血液都是起源于同一種細胞,即血液的祖細胞。血祖細胞最早起源于中胚層,繼而分化形成血管祖細胞和血液祖細胞。由血祖細胞分化而來的早期血細胞主要參與前期的造血,由血液祖細胞分化而來的造血干細胞調(diào)控定向造血,分化為成熟的髓系細胞、紅細胞以及淋巴細胞。血管祖細胞開始分化為血管內(nèi)皮(EC)細胞,之后分化為動脈、靜脈和淋巴血管等。血液與血管的發(fā)育過程是在復雜而有序的分子信號網(wǎng)絡的調(diào)控下進行的,其出現(xiàn)異常會導致嚴重的發(fā)育缺陷或疾病。目前,調(diào)控造血體系與血管體系發(fā)育的分子機制還未研究清楚,探究血液與血管發(fā)育過程中的重要分子有助于完善血液與血管發(fā)育過程的分子信號網(wǎng)絡,對心臟和心血管病的治療提供新的個性化治療手段和方法。本論文通過斑馬魚模型探索HFHG45對于血管發(fā)育和造血干細胞分化的影響。本實驗室前期已建立穩(wěn)定的HFHG45敲除品系。本文利用標志分子探針檢測不同類型的血細胞,造血干細胞和血管標志基因在HFHG45完全敲除品系中的表達情況。主要以Notch信號,shh信號等重要信號通路的相關(guān)標志基因進行檢測。主要檢測的標志基因如下:shh和myod1(體節(jié)細胞標志基因),dld和dlc(notch信號配體),pax7a(肌生節(jié)細胞標志基因),pax2a和cdh17(前腎標志基因),amhc(心臟標志基因),scl和etv2(造血干細胞標志基因)。結(jié)果表明,在斑馬魚中敲除HFHG45明顯下調(diào)了shh,scl,dld,dlc,pax7a,pax2a,cdh17,amhc,etv2和myod1的表達。綜上所述,HFHG45可能通過Notch信號和shh信號調(diào)控血細胞分化和血管發(fā)育,但其對心臟,包括心房以及心室的影響并不明顯。
【關(guān)鍵詞】：斑馬魚 HFHG45 血細胞 整體胚胎原位雜交
【學位授予單位】：湖南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R54;Q78
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 1 引言和文獻綜述11-23
• 1.1 模式生物斑馬魚11-12
• 1.2 模式生物斑馬魚的造血過程12-14
• 1.2.1 斑馬魚得原始造血12-13
• 1.2.2 斑馬魚的定向造血13-14
• 1.3 模式生物斑馬魚的血管發(fā)育過程14-15
• 1.4 斑馬魚造血中涉及到重要調(diào)節(jié)基因和信號通路15-18
• 1.4.1 影響斑馬魚造血重要的標記基因15
• 1.4.2 調(diào)控斑馬魚造血過程的信號通路15-18
• 1.5 斑馬魚的發(fā)育時期特征18
• 1.6 整體胚胎原位雜交技術(shù)18-19
• 1.7 本文的前期研究基礎19-21
• 1.8 本文的研究意義21-23
• 2 材料和方法23-37
• 2.1 材料23-25
• 2.1.1 實驗動物23
• 2.1.2 菌種及載體、主要試劑、試劑盒23-24
• 2.1.3 主要試劑的配置24
• 2.1.4 主要實驗儀器和耗材24-25
• 2.2 方法25-37
• 2.2.1 斑馬魚的生長環(huán)境的控制、飼養(yǎng)以及配種25-26
• 2.2.2 常規(guī)的分子克隆方法26-31
• 2.2.3 斑馬魚整體胚胎原位雜交31-34
• 2.2.4 WESTERN BLOTTING34-35
• 2.2.5 CRISPR/CAS9實驗方法35-37
• 3 實驗結(jié)果和分析37-51
• 3.1 整體胚胎原位雜交探針的合成37-45
• 3.1.1 DCL, DLD等血液發(fā)育相關(guān)標志基因探針的合成37-39
• 3.1.2 血液發(fā)育相關(guān)標志基因GATA2, SCL, TRIM45, FLK1, HAND2等探針的合成39-44
• 3.1.3 RNA探針的制備44-45
• 3.2 HFHG45在斑馬魚造血中的作用45-51
• 3.2.1 通過WISH檢測CDH17表達情況45-46
• 3.2.2 通過WISH檢測TAL1表達情況46-47
• 3.2.3 通過WISH檢測ESTRP表達情況47-48
• 3.2.4 通過WISH檢測DLD, DLC表達情況48-49
• 3.2.5 通過WISH檢測SHH表達情況49
• 3.2.6 通過WISH檢測PAX7A表達情況49-50
• 3.2.7 WISH樣品基因型鑒定情況50-51
• 4 討論51-53
• 5 結(jié)語53-54
• 6 其他工作54-58
• 6.1 構(gòu)建PMCS1-IRES-EGFP載體54
• 6.2 利用CRISPR/CAS9系統(tǒng)構(gòu)建斑馬魚POP1/POP2敲除品系54-57
• 6.2.1 目的序列分析和打靶位點設計54
• 6.2.2 打靶GRNA設計54-57
• 6.3 HFHG45抗體的特異性檢測57-58
• 參考文獻58-62
• 中英文縮寫詞簡表62-63
• 攻讀學位期間的學術(shù)論文63-64
• 致謝64-65

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