本文關(guān)鍵詞：過(guò)表達(dá)mitf基因腺相關(guān)病毒的構(gòu)建與鑒定

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【摘要】：目的獲得能夠過(guò)表達(dá)小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(mitf)的重組腺相關(guān)病毒載體,用于mitf基因突變相關(guān)疾病的基因治療。方法利用PCR擴(kuò)增獲得目的基因,構(gòu)建攜帶目的基因mitf的重組腺相關(guān)病毒載體,利用人工脂質(zhì)體法將p AAV-RC,p Helper,以及p AAV-GFP系列載體轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中,采用細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒DNA同源重組法進(jìn)行重組腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建,利用柱純化法純化病毒載體,q PCR法測(cè)定重組腺相關(guān)病毒載體滴度,病毒載體感染HEK293細(xì)胞進(jìn)行病毒有效性及安全性鑒定,real-time PCR與western blot法進(jìn)行mitf表達(dá)的鑒定。結(jié)果 PCR擴(kuò)增和測(cè)序結(jié)果一致證實(shí)成功獲得目的基因并且成功構(gòu)建mitf基因腺相關(guān)病毒載體,測(cè)得高水平病毒滴度1.0~*10~^12vg/ml,病毒載體感染HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率為86.3%,并未發(fā)現(xiàn)HEK293細(xì)胞死亡,Real-time PCR及Western blot檢測(cè)構(gòu)建Mitf基因轉(zhuǎn)錄m RNA與表達(dá)的蛋白與正常MITF一致。結(jié)論成功構(gòu)建的攜帶mitf基因的重組腺相關(guān)病毒載體為未來(lái)進(jìn)行mitf突變導(dǎo)致的遺傳性疾病的基因治療提供新思路。
【作者單位】： 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科福建省耳鼻咽喉研究所;解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科解放軍耳鼻咽喉研究所聾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【關(guān)鍵詞】： ITF 腺相關(guān)病毒 基因治療
【基金】：國(guó)家863青年科學(xué)家項(xiàng)目(2014AA020510) 國(guó)家自然科學(xué)基金(面上項(xiàng)目81271082,青年基金81400472) 北京科技創(chuàng)新基地培育與發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)(z151100001615050) 福建省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目(2014I0003) 中國(guó)科協(xié)創(chuàng)新驅(qū)動(dòng)助力工程(2016CXQD01)
【分類(lèi)號(hào)】：R450;R596.1
【正文快照】： 小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)位于小鼠6號(hào)染色體,人類(lèi)染色體3p12.3 14.1位點(diǎn),由Mitf基因編碼的含有419個(gè)氨基酸,分子量大小約為46k Da,具有組織特異性的,含有堿性螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈(b HLH-Zip)的二聚體結(jié)構(gòu)[1-3]。Mitf通過(guò)b HLH-Zip結(jié)構(gòu)域識(shí)別位于靶基因啟動(dòng)子區(qū)上的E-bo

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