本文關(guān)鍵詞：CCDC67基因在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及臨床意義

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【摘要】：背景及目的近年來(lái),甲狀腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì),而且作為高發(fā)性內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見(jiàn)的腫瘤,越來(lái)越引起人們的關(guān)注。甲狀腺癌的主要病理類型包括:分化型甲狀腺癌、未分化甲狀腺癌和來(lái)源于濾泡旁C細(xì)胞的甲狀腺髓樣癌,分化型甲狀腺癌又由甲狀腺乳頭狀癌、濾泡狀甲狀腺癌組成。其中,分化型甲狀腺癌占所有甲狀腺癌的90%以上,是一種常見(jiàn)的、多樣化的內(nèi)分泌惡性腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)分化型甲狀腺癌的患者存在著一定可治愈性,但是復(fù)發(fā)率相對(duì)較高,大約在10%~30%,而且5%的患者對(duì)常規(guī)的治療是無(wú)法治愈的,所以我們需要找到有效治療此類患者的方法。在過(guò)去的20年里,甲狀腺癌分子生物學(xué)取得顯著進(jìn)展,大量的甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)突變基因被發(fā)現(xiàn)。因此,我們需要進(jìn)一步了解這些基因在甲狀腺癌中的作用機(jī)制以及與臨床的相關(guān)性,為分化型甲狀腺癌的治療奠定基礎(chǔ),并將這些知識(shí)從理論轉(zhuǎn)移到臨床決策中去。最近一項(xiàng)研究表明位于11號(hào)染色長(zhǎng)臂體上的CCDC67基因是一個(gè)新的候選抑癌基因,而且發(fā)現(xiàn)其在胃癌、乳腺癌等惡性腫瘤中表達(dá)缺失或降低,但是其在甲狀腺癌中的研究卻鮮有報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)首先在細(xì)胞學(xué)水平,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)分化型甲狀腺癌細(xì)胞株中CCDC67mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行分析;然后通過(guò)細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)CCDC67蛋白在分化型甲狀腺癌中的表達(dá)分布情況。接著,收集臨床甲狀腺癌組織學(xué)標(biāo)本,通過(guò)免疫組化技術(shù)檢測(cè)CCDC67基因在臨床甲狀腺癌患者中的表達(dá)情況,并結(jié)合臨床病理特征分析其相關(guān)性。最后,進(jìn)一步探索CCDC67基因在甲狀腺腫瘤中的分子作用機(jī)制,提取將標(biāo)本中的DNA,通過(guò)DNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)CCDC67與甲狀腺癌經(jīng)典基因BREAF V600E的相關(guān)性,接著用慢病毒轉(zhuǎn)染甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞,使得細(xì)胞中的CCDC67過(guò)表達(dá),并分析轉(zhuǎn)染前后甲狀腺乳頭狀癌中凋亡相關(guān)因子的表達(dá)情況。這些為判定CCDC67基因在甲狀腺腫瘤中的作用,其是否可以作為甲狀腺癌的抑癌基因,以及基因?qū)W靶向治療等方面奠定了一定的理論依據(jù)。材料與方法1、采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)分化型甲狀腺癌細(xì)胞株(TCP-1、FTC-133)CCDC67mRNA的表達(dá)情況,與正常甲狀腺細(xì)胞株(Nthy-ori 3-1)進(jìn)行比較。2、細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)分化型甲狀腺癌細(xì)胞株(TCP-1、FTC-133)CCDC67蛋白的表達(dá)及分布情況,與正常甲狀腺細(xì)胞株(Nthy-ori 3-1)進(jìn)行比較。3、收集臨床60例臨床甲狀腺癌組織學(xué)標(biāo)本。通過(guò)免疫組化技術(shù)檢測(cè)CCDC67基因在臨床甲狀腺癌患者的手術(shù)組織切片中的表達(dá)情況,并分析其與臨床病理的相關(guān)性。4、提取組織標(biāo)本中的DNA,通過(guò)DNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)CCDC67基因與甲狀腺癌經(jīng)典基因BREAF V600E的相關(guān)性。5、構(gòu)建CCDC67過(guò)表達(dá)的TPC-1細(xì)胞,通過(guò)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax的變化。6、采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,其中兩樣本率的比較采用卡方檢驗(yàn),用單因素方差分析對(duì)多樣本進(jìn)行比較,用t檢驗(yàn)對(duì)兩組定量資料進(jìn)行比較,以P0.05為彼此差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1、與正常甲狀腺細(xì)胞株(Nthy-ori 3-1)相比,在分化型甲狀腺癌細(xì)胞株中(TPC-1、FTC-133)CCDC67 mRNA表達(dá)明顯降低,P0.05。2、與正常甲狀腺細(xì)胞株(Nthy-ori 3-1)相比,在分化型甲狀腺癌細(xì)胞株中(TPC-1、FTC-133)CCDC67蛋白表達(dá)明顯降低,P0.05,CCDC67蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。3、60例癌旁正常甲狀腺組織中均出現(xiàn)CCDC67蛋白的表達(dá),PTC組織中52%(31/60)出現(xiàn)CCDC67蛋白的表達(dá)缺失,CCDC67蛋白表達(dá)的缺失情況與患者的TNM分期、組織病理分級(jí)以及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)(P0.05)4、CCDC67的低表達(dá)與BRAF突變正相關(guān),r=0.707,P0.05。5、慢病毒轉(zhuǎn)染TPC-1細(xì)胞獲得CCDC67高表達(dá),使得Bcl-2 mRNA表達(dá)降低,Bax mRNA表達(dá)升高,P0.05。結(jié)論CCDC67基因在甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)缺失,缺失表達(dá)CCDC67的患者與其TNM分期、病理分級(jí)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),而且與經(jīng)典BRAF基因突變正相關(guān),通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染TPC-1獲得高表達(dá)的CCDC67后,使得TPC-1惡性表型受到逆轉(zhuǎn),促進(jìn)了TPC-1細(xì)胞凋亡的形成,證實(shí)了CCDC67基因作為甲狀腺乳頭狀癌的一個(gè)抑癌基因。
【關(guān)鍵詞】：甲狀腺癌 分化型甲狀腺癌 CCDC67基因 BRAF突變
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R736.1
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 縮略詞表12-13
• 引言13-16
• 第一部分 CCDC67基因在分化型甲狀腺癌細(xì)胞株的表達(dá)情況16-30
• 一 一般資料16-19
• 1 研究對(duì)象16
• 2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器16-18
• 3 實(shí)驗(yàn)所需溶液的配置18-19
• 二 實(shí)驗(yàn)方法19-25
• 1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、凍存19-20
• 2 Real Time PCR（RT-PCR，實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)）20-24
• 3 免疫熒光技術(shù)24
• 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法24-25
• 三 實(shí)驗(yàn)結(jié)果25-28
• 1 RNA完整性25
• 2 Real Time-PCR檢測(cè)結(jié)果25
• 3 細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)結(jié)果25-28
• 四 討論28-29
• 五 結(jié)論29-30
• 第二部分 CCDC67基因在甲狀腺乳頭狀癌組織標(biāo)本中的表達(dá)情況30-37
• 一 一般資料30-31
• 1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象30
• 2 臨床分期及分級(jí)30
• 3 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器30-31
• 4 實(shí)驗(yàn)所需溶液的配置31
• 二 實(shí)驗(yàn)方法31-33
• 1 免疫組織化學(xué)SP法31-33
• 2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法33
• 三 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-36
• 1 免疫組化結(jié)果33-34
• 2 PTC中CCDC67蛋白的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系34-36
• 四 討論36
• 五 結(jié)論36-37
• 第三部分 CCDC67基因?qū)PC-1 細(xì)胞生物學(xué)功能的影響37-48
• 一 一般資料37-38
• 1 研究對(duì)象37
• 2 實(shí)驗(yàn)主要試劑和儀器37-38
• 3 DNA提取所需溶液配制38
• 二 實(shí)驗(yàn)方法38-41
• 1 DNA測(cè)序38-40
• 2 慢病毒轉(zhuǎn)染CCDC67基因?qū)PC-1 細(xì)胞生物學(xué)功能的影響40-41
• 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法41
• 三 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-44
• 1 DNA測(cè)序結(jié)果41
• 2 CCDC67基因與BRAF在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)相關(guān)性分析41
• 3 Real Time-PCR檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染TPC-1 前后凋亡相關(guān)基因的表達(dá)41-44
• 四 討論44-47
• 五 結(jié)論47-48
• 全文總結(jié)48-49
• 參考文獻(xiàn)49-54
• 綜述 甲狀腺癌靶向研究的熱點(diǎn)與展望54-68
• 參考文獻(xiàn)62-68
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷68-70
• 致謝70

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