本文關(guān)鍵詞：巴西橡膠樹冷脅迫基因HbICE1的克隆及功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：植物在生長過程中,常常會受到低溫冷害等非生物逆境脅迫的嚴(yán)重影響。由于橡膠屬于熱帶植物,不耐寒,所以是極易受到低溫冷害影響的植物之一。而ICE1是低溫脅迫信號通路中的重要轉(zhuǎn)錄激活因子,目前關(guān)于橡膠樹冷脅迫信號途徑中包括HbICE1在內(nèi)的大部分關(guān)鍵基因的研究還比較匱乏,與HbICE1發(fā)生互作的蛋白仍不清楚,成為嚴(yán)重阻礙研究橡膠抗寒分子機(jī)理的瓶頸。本研究首先克隆HbICE1基因,分析其基因表達(dá)調(diào)控特點(diǎn),然后鑒定HbICE1的互作蛋白,得到以下研究結(jié)果：1.通過電子克隆技術(shù),得到.HbICE1基因的全長cDNA序列,然后設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增cDNA的全長編碼區(qū),測序結(jié)果與預(yù)測序列一致。其編碼470個氨基酸,蛋白分子質(zhì)量約為51kDa,理論等電點(diǎn)(pI)為5.83,為親水性蛋白。2.經(jīng)亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)分析,HbICE1蛋白位于細(xì)胞核上。實(shí)時熒光定量分析表明：MICE1基因在不同組織下都有表達(dá),但在葉片中的表達(dá)最高。在不同脅迫處理下,HbICE1的表達(dá)模式也存在著較大的差異。3.構(gòu)建HbICE1的cDNA全長編碼框的植物過量表達(dá)載體pEGAD,然后利用電擊轉(zhuǎn)化法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中,再利用浸花侵染法將其轉(zhuǎn)入擬南芥,獲得了F1代植株12株,為后續(xù)轉(zhuǎn)基因株系耐受低溫脅迫的檢測分析及HbICE1的生物學(xué)功能鑒定奠定了基礎(chǔ)。4.構(gòu)建橡膠HbICE1基因的pGBKT7酵母雙雜交誘餌載體,并轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2H Gold,利用酵母雙雜技術(shù)篩選橡膠雙鏈cDNA文庫與HbICE1互作的蛋白。對文庫中獲得的互作菌株提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌,選擇其中48個解析測序,獲得33個單一序列,并在NCBI上進(jìn)行比對和注釋。5.為了驗(yàn)證HbICE1是否受到茉莉酸信號途徑調(diào)控,我們通過酵母雙雜交檢驗(yàn)HbICE1與7個橡膠HbJAZ蛋白之間的相互作用,發(fā)現(xiàn)HbICE1與其中的HbJAZ1發(fā)生互作,說明茉莉酸信號確實(shí)可能通過HbJAZ1與ICE1發(fā)生互作從而參與低溫脅迫響應(yīng)調(diào)控。本研究將有助于解析橡膠樹冷脅迫應(yīng)答的分子機(jī)理,為探索橡膠樹抗寒機(jī)理提供重要的理論意義和經(jīng)濟(jì)價值,為后續(xù)更好的研究巴西橡膠樹的低溫脅迫信號通路及分子遺傳育種奠定了良好的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：巴西橡膠樹 HbICE1 表達(dá)分析 酵母雙雜
【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S794.1;Q943.2
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 1 引言9-18
• 1.1 巴西橡膠樹的研究背景9
• 1.2 植物對低溫脅迫的響應(yīng)9-13
• 1.2.1 低溫脅迫對植物的影響9-10
• 1.2.2 植物對低溫脅迫的響應(yīng)10-13
• 1.3 低溫脅迫與其它抗寒相關(guān)因子13-14
• 1.4 酵母雙雜技術(shù)概述14-16
• 1.4.1 酵母雙雜交技術(shù)的原理14-15
• 1.4.2 酵母雙雜交技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)15-16
• 1.5 本研究的目的及意義16-17
• 1.6 本研究的技術(shù)路線17-18
• 2 材料與方法18-35
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑18-19
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料18
• 2.1.2 酶、試劑及化學(xué)藥品18-19
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及工具19
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法19-35
• 2.2.1 橡膠HbICE1的cDNA全長克隆19-24
• 2.2.2 HbICE1的多序列比對及進(jìn)化樹構(gòu)建24
• 2.2.3 HbICE1的表達(dá)模式分析24-25
• 2.2.4 橡膠HbICE1的亞細(xì)胞定位分析25-26
• 2.2.5 HbICE1轉(zhuǎn)基因株系的獲得及表達(dá)分析26-30
• 2.2.6 HbICE1的自轉(zhuǎn)錄活性分析30-31
• 2.2.7 酵母雙雜篩選HbICE1的互作蛋白31-33
• 2.2.8 橡膠HbICE1與HbJAZs的互作分析33-35
• 3 結(jié)果與分析35-53
• 3.1 橡膠HbICE1的克隆與生物信息學(xué)分析35-39
• 3.2 HbICE1在生物及非生物逆境脅迫下的表達(dá)模式39-41
• 3.3 HbICE1的亞細(xì)胞定位41-42
• 3.4 HbICE1過表達(dá)轉(zhuǎn)化擬南芥的初步篩選42-45
• 3.4.1 構(gòu)建植物表達(dá)載體及轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌42-43
• 3.4.2 HbICE1轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR鑒定43-45
• 3.5 酵母雙雜交篩選HbICE1的互作蛋白45-50
• 3.5.1 誘餌載體的構(gòu)建45
• 3.5.2 轉(zhuǎn)錄自激活檢測45-47
• 3.5.3 酵母雙雜文庫滴定檢測47
• 3.5.4 HbICE1酵母雙雜文庫的篩選47-50
• 3.6 HbICE1與HbJAZs的互作分析50-53
• 3.6.1 pGADT7-HbICE1捕獲載體的構(gòu)建50
• 3.6.2 pGBKT7-HbJAZs誘餌載體的自激活檢測與互作分析50-53
• 4 討論53-55
• 5 結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-60
• 附錄60-66
• 致謝66

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：495381