發(fā)布時(shí)間：2017-06-15 23:10

  本文關(guān)鍵詞：夏枯草迷迭香酸合成途徑關(guān)鍵酶基因的克隆及毛狀根體系的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：夏枯草(Prunella vulgaris L.)是中國(guó)乃至亞洲地區(qū)廣泛使用的藥用植物,具有多樣的藥理作用�！吨腥A人民共和國(guó)藥典》(2015版,一部)中規(guī)定,迷迭香酸(rosmarinic acid,RA)是用于鑒定夏枯草藥材品質(zhì)的指標(biāo)性成分。同時(shí)迷迭香酸也具有多種生物活性,是一種重要的酚酸類次生代謝產(chǎn)物,其生物活性和生源途徑都被廣泛地研究。本研究采用同源克隆的方法克隆了夏枯草迷迭香酸生源途徑上兩個(gè)重要酶的基因,即迷迭香酸合成酶(PvRAS)和細(xì)胞色素P450單加氧酶(PvCYP),并對(duì)它們的開(kāi)放閱讀框(Open reading frame,ORF)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,以確定這兩種蛋白的進(jìn)化分類;此外,本研究還構(gòu)建了夏枯草的毛狀根培養(yǎng)體系,并研究了誘導(dǎo)子對(duì)毛狀根生物量、迷迭香酸積累及相關(guān)基因表達(dá)的影響。主要結(jié)果如下:1、PvRAS(KM053280)基因的cDNA包含一個(gè)1305 bp的ORF,編碼435個(gè)氨基酸;PvCYP(KM053281)基因的cDNA包含一個(gè)1530 bp的ORF,編碼510個(gè)氨基酸。組織特異性表達(dá)顯示,這兩個(gè)基因在多種組織器官中都檢測(cè)到表達(dá),且均是在根中表達(dá)量最高。PvRAS基因的表達(dá)量由多到少依次為:根葉莖果穗;PvCYP基因的表達(dá)量由多到少依次為:根莖葉果穗。2、PvRAS蛋白的理論分子質(zhì)量為48.1 kDa,等電點(diǎn)(p I)為5.97;PvCYP蛋白的理論分子質(zhì)量為57.8 kDa,等電點(diǎn)(p I)為8.62。它們與其它物種的RAS和CYP蛋白具有較高的一致性,且它們均含有四種二級(jí)結(jié)構(gòu)。通過(guò)比對(duì)氨基酸序列的相似性和進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建,得出結(jié)論,PvRAS蛋白屬于BAHD�；D(zhuǎn)移酶蛋白家族,而PvCYP蛋白屬于細(xì)胞色素P450超家族中的CYP98A亞家族。3、通過(guò)用發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC 15834侵染夏枯草的無(wú)菌苗葉片獲得夏枯草毛狀根。并用分子鑒定的方法鑒定出陽(yáng)性毛狀根株系。為篩選出最佳的誘導(dǎo)時(shí)機(jī),對(duì)鑒定出的陽(yáng)性毛狀根進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的測(cè)定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)毛狀根的生長(zhǎng)呈明顯的S型生長(zhǎng)曲線,而15 d左右的毛狀根長(zhǎng)勢(shì)最好,因此選用轉(zhuǎn)接后15 d的毛狀根作為誘導(dǎo)的材料添加誘導(dǎo)子。4、本研究選用乙烯利和水楊酸兩種誘導(dǎo)子處理夏枯草毛狀根并篩選最佳處理濃度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)200μg/L的乙烯利和6.9 mg/L的水楊酸具有最佳的誘導(dǎo)作用。篩選出合適的誘導(dǎo)劑量和最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)后,對(duì)夏枯草毛狀根進(jìn)行誘導(dǎo)處理,并在誘導(dǎo)后的不同時(shí)間點(diǎn)取樣。兩種誘導(dǎo)子均能增加毛狀根生物量和迷迭香酸的積累,而乙烯利的誘導(dǎo)作用較水楊酸更為明顯,加入乙烯利的毛狀根在第5 d達(dá)到迷迭香酸累積的最高值(63.5 mg/g),加入水楊酸的毛狀根在第2天達(dá)到迷迭香酸累積的最高值(58.3mg/g);在某些時(shí)間點(diǎn),兩種誘導(dǎo)子均未顯著上調(diào)PvRAS和PvCYP基因的表達(dá)量,加入誘導(dǎo)子的毛狀根,其基因表達(dá)水平與對(duì)照無(wú)顯著差異,或低于對(duì)照。但在加入SA誘導(dǎo)子0.5 d后,PvRAS和PvCYP基因的表達(dá)水平均顯著上調(diào);加入Eth誘導(dǎo)子5 d后,PvCYP的相對(duì)表達(dá)量表現(xiàn)出明顯的增長(zhǎng)。
【關(guān)鍵詞】：夏枯草 迷迭香酸 迷迭香酸合成酶 細(xì)胞色素P450 毛狀根 農(nóng)桿菌 乙烯利 水楊酸
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S567.239
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 第一章 文獻(xiàn)綜述11-27
• 1.1 中藥現(xiàn)代化11-13
• 1.1.1 天然產(chǎn)物藥物11-12
• 1.1.2 中藥現(xiàn)代化之路12-13
• 1.2 夏枯草研究概述13-17
• 1.2.1 夏枯草化學(xué)成分14-16
• 1.2.2 夏枯草藥理作用16-17
• 1.3 迷迭香酸研究概況17-21
• 1.3.1 迷迭香酸的發(fā)現(xiàn)17-18
• 1.3.2 迷迭香酸的合成途徑18-20
• 1.3.3 參與迷迭香酸生物合成的酶20-21
• 1.4 植物代謝工程21-24
• 1.4.1 誘導(dǎo)子調(diào)節(jié)22
• 1.4.2 關(guān)鍵酶調(diào)節(jié)22-23
• 1.4.3 Pathway Remodeling and De Novo Biosynthesis23-24
• 1.4.4 其他手段24
• 1.5 本研究的目的和意義24-26
• 1.6 本研究的技術(shù)路線26-27
• 第二章 夏枯草迷迭香酸合成途徑中關(guān)鍵酶基因的克隆與分析27-39
• 2.1 引言27
• 2.2 材料與方法27-31
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料27
• 2.2.2 主要試劑與儀器27-28
• 2.2.3 夏枯草PvRAS和PvCYP基因的獲得28-29
• 2.2.4 夏枯草PvRAS和PvCYP基因的組織表達(dá)分析29-30
• 2.2.5 夏枯草PvRAS和PvCYP蛋白氨基酸序列分析30-31
• 2.3 結(jié)果與分析31-38
• 2.3.1 夏枯草總RNA的提取和質(zhì)量檢測(cè)31
• 2.3.2 夏枯草PvRAS和PvCYP基因cDNA序列的克隆31-32
• 2.3.3 夏枯草PvRAS和PvCYP基因組織特異性表達(dá)分析32-33
• 2.3.4 夏枯草RAS和CYP蛋白氨基酸序列分析33-38
• 2.4 討論38-39
• 第三章 夏枯草毛狀根的誘導(dǎo)體系39-49
• 3.1 引言39
• 3.2 材料與方法39-42
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料39
• 3.2.2 主要試劑與儀器39-40
• 3.2.3 夏枯草無(wú)菌苗的培養(yǎng)40
• 3.2.4 夏枯草毛狀根的獲得與鑒定40-41
• 3.2.5 夏枯草毛狀根誘導(dǎo)子處理41-42
• 3.2.6 夏枯草毛狀根迷迭香酸含量的測(cè)定42
• 3.2.7 夏枯草毛狀根中PvRAS和PvCYP基因表達(dá)分析42
• 3.3 結(jié)果與分析42-47
• 3.3.1 夏枯草無(wú)菌苗的培養(yǎng)和毛狀根的獲得42-44
• 3.3.2 誘導(dǎo)子對(duì)夏枯草毛狀根的影響44-47
• 3.4 討論47-49
• 第四章 研究總結(jié)及展望49-51
• 參考文獻(xiàn)51-57
• 附錄57-58
• 致謝58-59
• 作者簡(jiǎn)介59

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