本文關(guān)鍵詞：棘孢木霉Hsp24基因轉(zhuǎn)化山新楊培育抗病轉(zhuǎn)基因株系，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：楊樹具有無性繁殖容易、生長速度快和生長周期短的特性,是重要的纖維用材,在全世界被廣泛種植。然而許多生物及非生物因子對楊樹的生長造成了嚴(yán)重的影響,減少了木材產(chǎn)量。而木霉作為優(yōu)良的生防真菌,具有大量的防衛(wèi)響應(yīng)及抗病基因,如熱激蛋白基因,其在木霉的生物防治機(jī)制中起到了十分重要的作用。本實驗以棘孢木霉ACCC30536轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),克隆到了熱激蛋白基因Hsp24的DNA序列,由于此基因無內(nèi)含子,cDNA與DNA序列一致,GenBank接受號為KP337939,全長為657bp,編碼218個氨基酸。生物信息學(xué)分析表明,熱激蛋白Hsp24的分子量為24.3kDa,等電點(diǎn)是5.50,屬于Hsp20家族。通過實時熒光定量方法,研究了棘孢木霉ACCC30536熱激蛋白基因Hsp24在10種條件下的表達(dá)特性,結(jié)果顯示,在堿、鹽、干旱、高溫和楊樹葉枯病及爛皮病發(fā)酵液脅迫下,熱激蛋白基因的表達(dá)量均上調(diào),尤其在高溫和楊樹爛皮病脅迫下上調(diào)最高,分別為51.6和31.1倍。為了構(gòu)建具備良好抗病性的山新楊轉(zhuǎn)化子,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將Hsp24基因整合到山新楊基因組上,并成功得到重組株系Pdpap-Hsp24s。RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)對照山新楊Pdpap-Con中無Hsp24基因表達(dá),而山新楊轉(zhuǎn)化子Pdpap-Hsp24s中Hsp24基因大量表達(dá),證實Hsp24已經(jīng)在轉(zhuǎn)化子中成功的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)基因楊樹病程相關(guān)蛋白基因PR表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子pROK2-Hsp24s中的大部分PR基因上調(diào)表達(dá),尤其是轉(zhuǎn)化子Pdpap-Hsp24-3中的PR-8被上調(diào)了215.93倍。在楊樹爛皮病的脅迫下,楊樹抗病信號傳遞相關(guān)基因的RT-qPCR發(fā)現(xiàn)Pdpap-Hsp24-3中的NPR1基因被上調(diào)了4.76倍,Pdpap-Hsp24-1中的JAR1和MYC2分別被上調(diào)了2.35和4.08倍。進(jìn)而,NBT及EtBr葉片染色發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子Pdpap-Hsp24s與對照Pdpap-Con相比葉片的顏色更淺,表明轉(zhuǎn)化子Pdpap-Hsp24s具有更強(qiáng)的抗楊樹爛皮病的能力。POD及SOD酶活性檢測發(fā)現(xiàn)Pdpap-Hsp24s與Pdpap-Con相比,POD及SOD酶活性更高,最高時分別達(dá)到37.7U和51.17U；用葉枯病侵染葉片后,發(fā)現(xiàn)Pdpap-Hsp24s和Pdpap-Con的葉片發(fā)病率分別為53%和81%,表明山新楊轉(zhuǎn)化子Pdpap-Hsp24s具有更強(qiáng)的抗楊樹葉枯病的能力。綜上所述,棘孢木霉ACCC30536熱激蛋白Hsp24基因在山新楊中的表達(dá)提高了轉(zhuǎn)化子Pdpap-Hsp24s的抗病能力。本研究使人們更加深刻的了解了真菌熱激蛋白能夠在木本植物中成功表達(dá),同時也提供了一種提高山新楊抗真菌病原菌能力的有效方法。
【關(guān)鍵詞】：棘孢木霉 熱激蛋白 轉(zhuǎn)基因 抗真菌能力 山新楊
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S763.7
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 1 緒論9-14
• 1.1 課題背景及意義9-10
• 1.2 國內(nèi)外文獻(xiàn)綜述及研究進(jìn)展10-13
• 1.2.1 植物轉(zhuǎn)基因方面10
• 1.2.2 生防木霉與病原菌互作10-12
• 1.2.3 熱激蛋白的功能12-13
• 1.3 研究不足及待深入研究的問題13
• 1.4 課題來源及研究內(nèi)容13-14
• 1.4.1 課題來源13
• 1.4.2 研究內(nèi)容13-14
• 2 棘孢木霉熱激蛋白基因Hsp24的克隆及分析14-26
• 2.1 實驗材料14-15
• 2.1.1 質(zhì)粒及菌株14
• 2.1.2 培養(yǎng)基及緩沖液14
• 2.1.3 藥品14
• 2.1.4 實驗器材14-15
• 2.2 實驗方法15-17
• 2.2.1 棘孢木霉基因組DNA的提取15
• 2.2.2 棘孢木霉Hsp24基因的克隆15-17
• 2.2.3 Hsp24啟動子區(qū)序列克隆17
• 2.2.4 Hsp24基因及蛋白的生物信息學(xué)特征17
• 2.3 實驗結(jié)果17-25
• 2.3.1 棘孢木霉基因組DNA的提取17-18
• 2.3.2 棘孢木霉Hsp24基因的克隆18
• 2.3.3 棘孢木霉Hsp24基因啟動子區(qū)克隆及分析18-19
• 2.3.4 棘孢木霉Hsp24基因的序列分析19-20
• 2.3.5 熱激蛋白Hsp24的生物信息特征分析20-25
• 2.4 熱激蛋白基因的克隆及生物信息分析的討論25
• 2.4.1 棘孢木霉Hsp24基因的克隆25
• 2.4.2 熱激蛋白及其基因的生物信息分析25
• 2.5 本章小結(jié)25-26
• 3 棘孢木霉熱激蛋白基因Hsp24的差異表達(dá)26-36
• 3.1 實驗材料26-27
• 3.1.1 菌株26
• 3.1.2 培養(yǎng)基26
• 3.1.3 藥品及工具酶26
• 3.1.4 實驗器材26-27
• 3.2 實驗方法27-29
• 3.2.1 棘孢木霉Hsp24基因的表達(dá)差異27-28
• 3.2.2 熒光定量PCR實驗28-29
• 3.3 實驗結(jié)果29-35
• 3.3.1 Hsp24基因在MM培養(yǎng)基中的表達(dá)29-30
• 3.3.2 生物因素脅迫下Hsp24基因的表達(dá)30-32
• 3.3.3 非生物壓力脅迫下Hsp24基因的表達(dá)32-35
• 3.4 棘孢木霉Hsp24基因表達(dá)情況的討論35
• 3.4.1 生物因素對Hsp24基因表達(dá)的影響35
• 3.4.2 非生物因素對Hsp24基因表達(dá)的影響35
• 3.5 本章小結(jié)35-36
• 4 山新楊轉(zhuǎn)化子Pdpap-Hsp24s的構(gòu)建36-46
• 4.1 實驗材料36-37
• 4.1.1 植物、菌株和質(zhì)粒36
• 4.1.2 培養(yǎng)基36-37
• 4.1.3 藥品和酶制劑37
• 4.1.4 實驗儀器37
• 4.2 實驗方法37-42
• 4.2.1 重組載體pROK2-Hsp24的構(gòu)建37-39
• 4.2.2 重組根癌農(nóng)桿菌EHA105-Hsp24的構(gòu)建39-41
• 4.2.3 山新楊轉(zhuǎn)化子Pdpap-Hsp24的獲得41-42
• 4.3 實驗結(jié)果42-45
• 4.3.1 重組載體pROK2-Hsp24的構(gòu)建42-44
• 4.3.2 山新楊轉(zhuǎn)化子Pdpap-Hsp24的擴(kuò)繁與檢測44-45
• 4.4 植物表達(dá)載體及楊樹轉(zhuǎn)化子構(gòu)建的討論45
• 4.5 本章小結(jié)45-46
• 5 山新楊轉(zhuǎn)化子Pdpap-Hsp24s的抗病性檢測46-60
• 5.1 實驗材料46
• 5.1.1 植物材料及病原真菌菌株46
• 5.1.2 培養(yǎng)基46
• 5.1.3 藥品和酶制劑46
• 5.1.4 實驗器材46
• 5.2 試驗方法46-49
• 5.2.1 四個轉(zhuǎn)化子株系中病程相關(guān)蛋白的表達(dá)分析46-47
• 5.2.2 楊樹爛皮病脅迫下楊樹轉(zhuǎn)化子防衛(wèi)信號途徑相關(guān)基因的分析47-48
• 5.2.3 楊樹爛皮病脅迫下山新楊轉(zhuǎn)化子細(xì)胞膜透性及活性氧含量測定48
• 5.2.4 葉枯病菌脅迫下楊樹轉(zhuǎn)化子Pdpap-Hsp24抗氧化能力分析48-49
• 5.2.5 山新楊轉(zhuǎn)化子Pdpap-Hsp24的抗葉枯病能力檢測49
• 5.3 實驗結(jié)果49-57
• 5.3.1 山新楊轉(zhuǎn)化子中病程相關(guān)蛋白基因PR的表達(dá)檢測49-51
• 5.3.2 楊樹爛皮病的脅迫下楊樹轉(zhuǎn)化子防衛(wèi)信號途徑相關(guān)基因的表達(dá)51-53
• 5.3.3 楊樹爛皮病的脅迫下楊樹轉(zhuǎn)化子的細(xì)胞膜透性及活性氧含量53-55
• 5.3.4 楊樹葉枯病的脅迫下楊樹轉(zhuǎn)化子的抗氧化能力分析55-56
• 5.3.5 轉(zhuǎn)化子Pdpap-Hsp24的抗楊樹葉枯病能力檢測56-57
• 5.4 山新楊轉(zhuǎn)化子Pdpap-Hsp24抗病能力討論57-59
• 5.4.1 轉(zhuǎn)化子Pdpap-Hsp24病程相關(guān)基因的表達(dá)57
• 5.4.2 轉(zhuǎn)化子Pdpap-Hsp24抗楊樹爛皮病的能力57-58
• 5.4.3 轉(zhuǎn)化子Pdpap-Hsp24抗楊樹葉枯病的能力58-59
• 5.5 本章小結(jié)59-60
• 結(jié)論60-61
• 參考文獻(xiàn)61-66
• 附錄66-67
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文67-68
• 致謝68-69

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本文編號：441144