本文關(guān)鍵詞：腎蕨查爾酮合成酶基因的克隆、表達(dá)及其影響因素，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：蕨類植物具有豐富黃酮類化合物,是蕨類中重要的藥用成分;蕨類黃酮的代謝途徑仍不清楚,闡明其代謝途徑對解釋蕨類植物黃酮代謝的機(jī)制,調(diào)控黃酮的表達(dá)具有重要意義;腎蕨(Nephrolepis auriculata(Eaton)O.Ktze)是傳統(tǒng)的中藥材,含有豐富的黃酮類化合物,具有治療感冒發(fā)燒、咳嗽、痢疾及抗癌等功能。腎蕨具有容易采集、培養(yǎng)的特點(diǎn),本文以腎蕨為材料,對其黃酮含量進(jìn)行了測定,克隆到其查爾酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因,并對該基因做了原核表達(dá),對其進(jìn)行原核表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化及基因功能的分析。本研究對闡明蕨類植物黃酮代謝及調(diào)控的機(jī)制具有一定的科學(xué)意義。本研究獲得的主要結(jié)果如下:1.分別對腎蕨的根莖、葉軸、羽片總黃酮進(jìn)行了測定,結(jié)果表明腎蕨含有豐富的黃酮,葉軸和羽片中的黃酮含量均為2%左右,根莖中的黃酮含量顯著高于地上部分,達(dá)到6%。由此腎蕨可作為試驗(yàn)材料進(jìn)行黃酮代謝途徑分子生物學(xué)研究。2.對腎蕨的查爾酮合成酶進(jìn)行基因克隆與功能分析:以腎蕨葉中提取的RNA為模板,通過PCR技術(shù)獲得腎蕨的查爾酮合成酶基因ORF序列和基因組序列。生物信息學(xué)分析表明,該基因ORF區(qū)為1209 bp,編碼402個氨基酸,蛋白酶分子量為44 KD。含有一個內(nèi)含子并且遵循gt/ag剪切規(guī)則。BLAST序列比對發(fā)現(xiàn)腎CHS基因(Na CHS)與其它物種的該基因同源,通過構(gòu)建進(jìn)化樹進(jìn)行同源性分析,表明Na CHS基因與漸尖毛蕨、槐葉萍、水蕨等蕨類的CHS基因親緣關(guān)系更近。分析表明不同物種CHS基因在序列上有差異,這種差異對揭示物種間親緣關(guān)系有重要意義,或者對基因功能有一定影響。將CHS目的片段與Pet32a載體連接構(gòu)建原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中,使用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá),進(jìn)行SDS-PAGE分析,腎蕨CHS基因在大腸桿菌中得到表達(dá),形成了一個大小為63 KD的蛋白,與預(yù)期結(jié)果相符合。體外酶活實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了原核表達(dá)的腎蕨CHS蛋白具有活性,能催化底物生成柚皮素,進(jìn)一步說明表達(dá)的蛋白為Na CHS。3.原核表達(dá)影響因素。(1)以IPTG為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)蛋白表達(dá),對表達(dá)的蛋白進(jìn)行定量檢測,蛋白表達(dá)量呈增長趨勢,且在表達(dá)1 h時(shí)蛋白表達(dá)變化量最明顯,4 h時(shí)累計(jì)蛋白表達(dá)量最多;(2)設(shè)置IPTG濃度梯度,在誘導(dǎo)表達(dá)4h時(shí)取樣檢測菌體濃度及進(jìn)行蛋白定量檢測,隨著IPTG濃度增大,菌體生長有受到抑制趨勢,加入IPTG濃度至0.1-0.2 mmol/L蛋白表達(dá)量較大;(3)設(shè)置溫度梯度,分別為25℃、28℃、31℃、34℃、37℃及40℃,隨溫度增高表達(dá)蛋白總量有增大趨勢,其他實(shí)驗(yàn)證實(shí)在37℃時(shí)菌體生長最快,且本實(shí)驗(yàn)證實(shí)在37℃表達(dá)的CHS中依然有一部分具有可溶性,最適表達(dá)溫度為37℃;(4)設(shè)置菌體誘導(dǎo)表達(dá)前濃度梯度,濃度分別為0.224,0.385,0.621,1.120。在菌體濃度為0.621和1.120表達(dá)量較高。綜上所述,黃酮含量測定表明腎蕨含有豐富的黃酮類化合物,分子生物學(xué)研究表明克隆到的Na CHS基因表達(dá)的CHS是腎蕨黃酮類化合物生物合成途徑中的關(guān)鍵酶;功能分析表明Na CHS基因原核表達(dá)產(chǎn)物具有較高的酶活性;經(jīng)實(shí)驗(yàn)分析CHS最佳誘導(dǎo)條件為:菌體生長至OD600=0.6左右,以0.1 mmol/L IPTG在37℃誘導(dǎo)1 h為最佳表達(dá)條件。本研究為蕨類黃酮類化合物的生物合成途徑的研究奠定了基礎(chǔ),對闡明蕨類植物中黃酮類化合物生物合成的調(diào)控機(jī)制也具有一定意義。
【關(guān)鍵詞】：查爾酮合成酶 腎蕨 黃酮 原核表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：上海師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-14
• 第一章 前言14-29
• 1.1 蕨類植物概述14-19
• 1.1.1 蕨類植物的分類地位與分布14
• 1.1.2 蕨類植物的綜合利用價(jià)值14-16
• 1.1.3 蕨類植物分子生物學(xué)研究進(jìn)展16-17
• 1.1.4 腎蕨17-19
• 1.1.4.1 腎蕨的分類地位與分布17
• 1.1.4.2 腎蕨的形態(tài)特征與生境17-18
• 1.1.4.3 腎蕨的研究進(jìn)展18-19
• 1.2 黃酮類化合物研究進(jìn)展19-23
• 1.2.1 黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)與分類19-20
• 1.2.2 黃酮類化合物的功能20-21
• 1.2.3 黃酮類化合物的生物合成途徑21-22
• 1.2.4 蕨類植物中黃酮類化合物的研究進(jìn)展22-23
• 1.3 查爾酮合成酶研究進(jìn)展23-29
• 1.3.1 查爾酮合成酶基因的結(jié)構(gòu)23-24
• 1.3.2 查爾酮合成酶蛋白的結(jié)構(gòu)和作用底物24-25
• 1.3.3 查爾酮合成酶基因的進(jìn)化25-26
• 1.3.4 查爾酮合成酶基因的表達(dá)調(diào)控26-28
• 1.3.5 查爾酮合成酶在植物防御中的作用28-29
• 第二章 腎蕨查爾酮合成酶基因的克隆、原核表達(dá)及條件優(yōu)化29-50
• 2.1 引言29-30
• 2.2 材料和方法30-50
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料30-32
• 2.2.1.1 植物材料30
• 2.2.1.2 實(shí)驗(yàn)使用設(shè)備30-31
• 2.2.1.3 酶與分子生物學(xué)試劑31-32
• 2.2.1.4 實(shí)驗(yàn)菌株32
• 2.2.1.5 實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒32
• 2.2.1.6 實(shí)驗(yàn)重組質(zhì)粒32
• 2.2.1.7 引物合成與測序32
• 2.2.2 方法32-50
• 2.2.2.1 腎蕨各部分樣品總黃酮提取液含量的測定32-34
• 2.2.2.2 腎蕨總RNA的提取34-35
• 2.2.2.3 cDNA的合成35
• 2.2.2.4 設(shè)計(jì)簡并引物35-36
• 2.2.2.5 PCR獲得核心片段36
• 2.2.2.6 瓊脂糖凝膠電泳檢測36
• 2.2.2.7 核心片段的回收純化36-37
• 2.2.2.8 核心片段的連接、轉(zhuǎn)化及鑒定37
• 2.2.2.9 NaCHS基因的 3’RACE37-38
• 2.2.2.10 NaCHS基因的 5’RACE38-42
• 2.2.2.11 腎蕨查爾酮合成酶基因ORF序列的獲得42-43
• 2.2.2.12 構(gòu)建原核表達(dá)載體43-45
• 2.2.2.13 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)和鑒定45-47
• 2.2.2.14 腎蕨查爾酮合成酶活性測定47-48
• 2.2.2.15 腎蕨查爾酮合基因原核表達(dá)條件優(yōu)化48-50
• 第三章 結(jié)果與討論50-67
• 3.1 蕨各部位總黃酮提取液含量的測定50
• 3.2 腎查爾酮合成酶（NACHS）基因的克隆50-55
• 3.2.1 腎蕨總RNA的提取50-51
• 3.2.2 腎蕨查爾酮合成酶基因核心片段克隆結(jié)果51-52
• 3.2.3 3'端基因序列的克隆52-53
• 3.2.4 5'端基因序列的克隆53-54
• 3.2.5 腎蕨查爾酮合成酶ORF序列的獲得54-55
• 3.3 腎查爾酮合成酶（NACHS）基因的生物學(xué)分析55-57
• 3.3.1 腎蕨查爾酮合成酶ORF序列分析55
• 3.3.2 腎蕨查爾酮合成酶DNA man軟件分析55-56
• 3.3.3 腎蕨查爾酮合成酶Proteinblast分析56-57
• 3.4 腎查爾酮合成酶（NACHS）基因的原核表達(dá)57-60
• 3.4.1 載體和目的基因雙酶切鑒定57-58
• 3.4.2 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)和鑒定58
• 3.4.3 腎蕨查爾酮合成酶酶活測定58-60
• 3.5 腎查爾酮合成酶（NACHS）基因的原核表達(dá)條件優(yōu)化60-62
• 3.5.1 不同濃度IPTG對菌體生長和蛋白表達(dá)影響60
• 3.5.2 誘導(dǎo)時(shí)間對蛋白酶表達(dá)量影響60-61
• 3.5.3 誘導(dǎo)溫度對蛋白酶表達(dá)量影響61
• 3.5.4 誘導(dǎo)前菌體濃度對表達(dá)影響61-62
• 3.6 討論62-67
• 3.6.1 腎蕨中的黃酮化合物62-63
• 3.6.2 查爾酮合成酶基因的進(jìn)化63-64
• 3.6.3 查爾酮合成酶蛋白特性64-65
• 3.6.4 腎蕨查爾酮合成酶基因原核表達(dá)條件優(yōu)化探討65-67
• 第四章 總結(jié)與展望67-68
• 參考文獻(xiàn)68-76
• 致謝76-78
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果78

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 祝留記;;用顯微投影儀觀察腎蕨的孢子囊彈射孢子[J];生物學(xué)通報(bào);1988年02期

2 陳曉清;蘇育才;李曉晶;林燕清;盧丹清;;抗菌腎蕨多糖的提取與分離[J];漳州師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2006年04期

3 林秦文;;家鄉(xiāng)的腎蕨[J];大自然;2009年04期

4 馮莉，田興山，李庚午，朱命煒;腎蕨離體培養(yǎng)過程中形態(tài)發(fā)生的掃描電鏡觀察[J];電子顯微學(xué)報(bào);1994年05期

5 ;[J];;年期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 馮莉;田興山;李庚午;朱命煒;;腎蕨離體培養(yǎng)過程中形態(tài)發(fā)生的掃描電鏡觀察[A];第八次全國電子顯微學(xué)會議論文摘要集（Ⅰ）[C];1994年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 薛守紀(jì);盆栽腎蕨[N];中國花卉報(bào);2005年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 閆循齊;腎蕨查爾酮合成酶基因的克隆、表達(dá)及其影響因素[D];上海師范大學(xué);2016年

2 潘志明;砷汞鉛鎘復(fù)合污染土壤的腎蕨植物修復(fù)技術(shù)研究[D];成都理工大學(xué);2006年

3 崔秋芳;三種觀賞蕨的耐蔭性研究[D];西南大學(xué);2007年

  本文關(guān)鍵詞：腎蕨查爾酮合成酶基因的克隆、表達(dá)及其影響因素，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：440724