本文關(guān)鍵詞：基于16SrRNA基因的食源性致病菌的實時熒光PCR檢測研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：近年來食品安全事件頻發(fā)使得食品安全已經(jīng)成為了全民關(guān)注的共同話題。食品安全問題成為關(guān)系到各個層次的人的民生問題,而在各類食品安全事件中,由食源性致病菌引起的食物中毒是食品安全問題的主要方面。最常見的食源性致病菌有志賀氏菌(Shigella)、沙門氏菌(Salmonella)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等。目前國內(nèi)對食源性致病菌的檢測方法主要沿用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定法,其檢測過程復(fù)雜瑣碎,耗時太長,不僅靈敏度不高,且每次只能確定或排除一種病原菌,難以滿足對食源性致病菌快速準(zhǔn)確檢測的需要。因此,建立一種多重、快速、高效的檢測技術(shù)是十分必要的。本研究利用TaqMan探針技術(shù)建立了針對志賀氏菌(Shigella)、沙門氏菌(Salmonella)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)這三種主要食源性致病菌的多重實時熒光PCR檢測技術(shù)。利用16SrRNA基因作為靶基因設(shè)計熒光定量PCR引物和TaqMan探針,引物和探針雙重控制靶基因的選擇,具有很好的特異性和靈敏度。研究結(jié)果:(1)選取細(xì)菌16SrRNA基因作為靶基因,設(shè)計PCR引物,以志賀氏菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌三種菌為目標(biāo)菌,六種菌為對照菌,通過普通PCR擴(kuò)增及測序驗證,該引物可以作為兼并引物用于進(jìn)一步研究。(2)優(yōu)化建立針對單一細(xì)菌基因檢測的單一實時熒光定量PCR檢測體系,在單一實時PCR檢測體系的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化建立了三重實時熒光PCR檢測體系。(3)實時熒光PCR體系特異性良好,只有目標(biāo)菌株出現(xiàn)陽性擴(kuò)增信號。(4)靈敏度高,基因組DNA靈敏度為10-4 ng。(5)成功構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,繪制了3株菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線。研究結(jié)果表明,本課題建立的針對志賀氏菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的多重實時熒光PCR方法,簡便快捷,大大縮短了檢測時間。在食源性致病菌快速篩查方面具有良好的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：食源性致病菌 16SrRNA基因 多重實時熒光PCR TaqMan探針
【學(xué)位授予單位】：山東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R155.3
【目錄】：

• 中文摘要7-8
• Abstract8-10
• 第一章 文獻(xiàn)綜述10-23
• 1 研究背景10-12
• 2 本文涉及的三種主要食源性致病菌的概述12-14
• 2.1 志賀氏菌12-13
• 2.2 金黃色葡萄球菌13
• 2.3 沙門氏菌13-14
• 3 食源性致病菌檢測方法概況14-21
• 3.1 傳統(tǒng)檢測方法15
• 3.2 傳統(tǒng)平板檢測方法的改進(jìn)15
• 3.3 免疫學(xué)方法15-18
• 3.4 儀器分析技術(shù)18-19
• 3.5 分子生物學(xué)方法19-21
• 4 16SrRNA基因在致病菌檢測中的研究地位21-22
• 5 研究目的意義22
• 6 研究的主要內(nèi)容22-23
• 第二章 三種食源性致病菌的定性PCR檢測23-35
• 1 前言23
• 2 材料與方法23-27
• 2.1 材料23-25
• 2.1.1 菌株23
• 2.1.2 主要試劑23-24
• 2.1.3 儀器與設(shè)備24
• 2.1.4 培養(yǎng)基的配制24
• 2.1.5 溶液的配制24-25
• 2.2 方法25-27
• 2.2.1 菌株的活化及培養(yǎng)25
• 2.2.2 細(xì)菌基因組的提取25
• 2.2.3 DNA濃度及純度測定25-26
• 2.2.4 引物的設(shè)計與合成26
• 2.2.5 引物的處理26
• 2.2.7 兼并性檢測26
• 2.2.8 靈敏度檢測26-27
• 2.2.9 PCR產(chǎn)物純化及測序分析27
• 3 結(jié)果與分析27-34
• 3.1 主要供試菌株菌落形態(tài)圖27
• 3.2 細(xì)菌基因組提取27-28
• 3.3 DNA濃度及純度測定結(jié)果28-29
• 3.4 定性PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化結(jié)果29-30
• 3.5 兼并性驗證30-31
• 3.6 靈敏度驗證31-32
• 3.7 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果32-34
• 4 討論34-35
• 第三章 三重實時熒光PCR檢測35-51
• 1 前言35
• 2 材料與方法35-39
• 2.1 材料35-36
• 2.1.1 主要試劑35
• 2.1.2 儀器與設(shè)備35-36
• 2.1.3 生物信息學(xué)軟件36
• 2.2 方法36-39
• 2.2.1 引物與探針的設(shè)計36-37
• 2.2.2 多重實時熒光PCR體系建立37-38
• 2.2.3 熒光定量PCR性能評價38-39
• 2.2.4 模擬樣品試驗39
• 3 結(jié)果與分析39-49
• 3.1 三種致病菌的序列比對結(jié)果39-40
• 3.2 多重實時熒光PCR體系建立結(jié)果40-42
• 3.2.1 單重實時熒光PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果40-41
• 3.2.2 多重實時熒光PCR體系建立結(jié)果41-42
• 3.3 實時熒光PCR性能評價結(jié)果42-44
• 3.3.1 特異性42-43
• 3.3.2 三種致病菌的基因組DNA靈敏度擴(kuò)增結(jié)果43-44
• 3.4 模擬樣本檢測結(jié)果44-49
• 3.4.1 菌液計數(shù)結(jié)果44-45
• 3.4.2 模擬水樣的單重實時熒光PCR靈敏度結(jié)果45-46
• 3.4.3 模擬牛奶樣品的單重實時熒光PCR靈敏度結(jié)果46-47
• 3.4.4 模擬樣品的多重實時熒光PCR檢測結(jié)果47-49
• 4 討論49-51
• 第四章 三種致病菌陽性質(zhì)粒分子的構(gòu)建51-63
• 1 前言51
• 2 材料與方法51-55
• 2.1 材料51-52
• 2.1.1 主要試劑51
• 2.1.2 儀器與設(shè)備51
• 2.1.3 培養(yǎng)基與試劑配制51-52
• 2.1.4 生物信息學(xué)軟件52
• 2.2 方法52-55
• 2.2.1 DNA的連接52
• 2.2.2 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備52-53
• 2.2.3 細(xì)菌轉(zhuǎn)化過程53
• 2.2.4 藍(lán)白斑篩選53
• 2.2.5 重組質(zhì)粒驗證53-54
• 2.2.6 單菌落活化及質(zhì)粒提取54
• 2.2.7 質(zhì)粒DNA定性PCR驗證54
• 2.2.8 質(zhì)粒的測序鑒定54
• 2.2.9 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制54-55
• 3 結(jié)果與分析55-62
• 3.1 菌落PCR的初步鑒定結(jié)果55-56
• 3.2 質(zhì)粒DNA定性PCR結(jié)果56-57
• 3.3 質(zhì)粒的測序結(jié)果57-58
• 3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制結(jié)果58-62
• 4 討論62-63
• 第五章 結(jié)論63-64
• 參考文獻(xiàn)64-70
• 致謝70

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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  本文關(guān)鍵詞：基于16SrRNA基因的食源性致病菌的實時熒光PCR檢測研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：439266