本文關(guān)鍵詞：中間錦雞兒黃酮合成相關(guān)基因的克隆和功能鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：黃酮類化合物是一類天然的次生代謝產(chǎn)物,具有抗氧化,防治骨質(zhì)疏松,抗腫瘤等作用,現(xiàn)已得到廣泛的研究。本研究通過RT-PCR以及RACE技術(shù)從中間錦雞兒中克隆到了兩個黃酮類化合物合成途徑上的基因,分別是CiCHI(查爾酮異構(gòu)酶)和CiFLS(黃酮醇合成酶),并構(gòu)建了兩個基因的植物表達載體,轉(zhuǎn)化野生型擬南芥,結(jié)果如下：1、中間錦雞兒CiCHI基因cDNA全長1005bp,ORF為678bp(111bp-788bp),5'-UTR長110bp,3'-UTR長217bp,編碼226個氨基酸,推測的分子量為24.413KD,理論等電點為5.66,是一種穩(wěn)定的兩性蛋白；CiFL S基因全長為1844bp,ORF為 1020bp(568bp-1587bp),5'-UTR為567bp,3'-UTR為257bp,編碼340個氨基酸,推測的分子量為38.765KD,是一種不穩(wěn)定的疏水蛋白,理論等電點為6.01。2、利用實時熒光定量PCR檢測了不同處理下中間錦雞兒幼苗中這兩個基因的表達情況以及二者在不同組織部位的表達情況。CiCHI基因受到紫外、NaCl的誘導(dǎo),表達趨勢是先上升后下降,而ABA處理后其表達是受到抑制的；CiFLS基因?qū)@三種處理均沒有響應(yīng)。二者在中間錦雞兒幼苗中表達最高的部位是葉,表達最低的部位是根。3、構(gòu)建過表達載體p35S::CiCHI和p35S::CiFLS,并轉(zhuǎn)化野生型擬南芥,得到純合體株系。4、檢測過表達植株當中總黃酮和花青素含量。過表達CiCHI基因的擬南芥中總黃酮含量高于野生型擬南芥,而花青素含量變化不大；過表達CiFLS基因的擬南芥體內(nèi)的總黃酮及花青素含量沒有明顯變化。
【關(guān)鍵詞】：中間錦雞兒 CiCHI CiFLS 克隆 黃酮 花青素
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 縮略詞表8-9
• 1 引言9-18
• 1.1 黃酮類化合物的基本概況9-10
• 1.1.1 黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)與分類9
• 1.1.2 黃酮類化合物的功能9-10
• 1.2 黃酮類化合物的合成路徑10-11
• 1.3 查爾酮異構(gòu)酶11-15
• 1.3.1 查爾酮異構(gòu)酶的分離與分類11-12
• 1.3.2 CHI蛋白的結(jié)構(gòu)與作用機制12-13
• 1.3.3 CHI基因的表達特性13-14
• 1.3.4 CHI的系統(tǒng)進化14
• 1.3.5 CHI轉(zhuǎn)基因的應(yīng)用14-15
• 1.4 黃酮醇合成酶15-17
• 1.4.1 黃酮醇合成酶的功能與分離15-16
• 1.4.2 FLS在植物中的表達及調(diào)控16
• 1.4.3 FLS轉(zhuǎn)基因的應(yīng)用16-17
• 1.5 中間錦雞兒的概況17
• 1.6 研究目的及意義17-18
• 2 材料和方法18-27
• 2.1 試驗材料18-20
• 2.1.1 植物材料18
• 2.1.2 菌株與質(zhì)粒載體18
• 2.1.3 儀器與試劑18-19
• 2.1.4 引物合成與測序19-20
• 2.2 試驗方法20-27
• 2.2.1 植物材料的培養(yǎng)20
• 2.2.2 培養(yǎng)基的配制20
• 2.2.3 中間錦雞兒和擬南芥RNA提取及cDNA的獲得20-21
• 2.2.4 感受態(tài)的制備和目的片段的轉(zhuǎn)化21
• 2.2.5 質(zhì)粒的提取及純化21
• 2.2.6 目的片段的克隆21-23
• 2.2.7 目的片段的生物信息學(xué)分析23
• 2.2.8 不同脅迫處理下以及不同部位基因表達量的分析23
• 2.2.9 植物表達載體的構(gòu)建23-24
• 2.2.10 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化24
• 2.2.11 轉(zhuǎn)基因植株的篩選24
• 2.2.12 純合體植株CiCHI與CiFLS基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測24-25
• 2.2.13 純合體植株CiCHI與CiFLS蛋白的檢測(Western Blot)25
• 2.2.14 純合體植株體內(nèi)黃酮類化合物及花青素含量的檢測25-27
• 3 結(jié)果與分析27-40
• 3.1 中間錦雞兒總RNA的提取27
• 3.2 中間錦雞兒CiCHI和CiFLS基因全長序列的獲得27-29
• 3.2.1 CiCHI基因的保守片段克隆以及3’RACE和5’RACE27-28
• 3.2.2 CiFLS基因的3’RACE和5’RACE28
• 3.2.3 CiCHI和CiFLS基因cDNA的克隆結(jié)果及序列分析28-29
• 3.3 中間錦雞兒CiCHI和CiFLS基因的生物信息學(xué)分析29-32
• 3.3.1 氨基酸序列分析及蛋白理化性質(zhì)29-30
• 3.3.2 系統(tǒng)進化分析30-32
• 3.4 CiCHI與CiFLS基因?qū)Σ煌幚淼捻憫?yīng)及在不同部位的表達32-34
• 3.4.1 CiCHI與CiFLS基因?qū)V-C處理的響應(yīng)32
• 3.4.2 CiCHI與CiFLS基因?qū)aCl處理的響應(yīng)32-33
• 3.4.3 CiCHI與CiFLS基因?qū)BA處理的響應(yīng)33-34
• 3.4.4 CiCHI與CiFLS基因在不同部位的表達34
• 3.5 篩選CiCHI和CiFLS轉(zhuǎn)基因純合體植株34-37
• 3.5.1 CiCHI和CiFLS基因的過表達載體構(gòu)建34-35
• 3.5.2 轉(zhuǎn)基因植株的篩選35-36
• 3.5.3 轉(zhuǎn)基因純合體植株轉(zhuǎn)錄水平的qRT-PCR檢測結(jié)果36-37
• 3.5.4 轉(zhuǎn)基因純合體植株蛋白的檢測37
• 3.6 轉(zhuǎn)基因純合體植株總黃酮及花青素含量的檢測37-40
• 3.6.1 過表達CiCHI基因的轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)總黃酮及花青素的含量37-39
• 3.6.2 過表達CiFLS基因的轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)總黃酮及花青素的含量39-40
• 4 討論與結(jié)論40-42
• 4.1 討論40-41
• 4.1.1 過表達CiCHI基因提高植株體內(nèi)總黃酮的含量40
• 4.1.2 過表達CiFLS基因未能改變植株體內(nèi)總黃酮及花青素的含量40-41
• 4.2 結(jié)論41-42
• 致謝42-43
• 參考文獻43-50
• 作者簡介50

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