發(fā)布時間：2025-05-07 23:00

　　 目的克隆多房棘球絳蟲(Echinococcus multilocularis, Em)絲氨酸蛋白酶(SP)基因,通過原核系統(tǒng)表達Em-SP并對其抗原性進行鑒定。方法 PCR擴增獲得Em-SP片段;構建重組質粒pET30a-Em-SP,NdeI/HindIII雙酶切并測序,將測序正確的重組質粒轉化至E.coli BL21(DE3)菌株中,用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達,采用SDS-PAGE電泳分析表達蛋白的分子質量單位和表達豐度。表達產物經(jīng)親和層析(Ni-IDA樹脂)純化后采用Western blot鑒定蛋白的反應原性。結果 PCR擴增SP基因片段為1 374 bp,重組質粒pET30a-Em-SP酶切后電泳和測序表明閱讀框架序列與設計一致。IPTG誘導重組質粒轉化菌表達蛋白主要以包涵體形式存在,表達蛋白的相對分子質量約為51×10～3,與預期值大小相符,且能被鼠抗His-Tag抗體識別,用包蟲患者血清Western blot鑒定呈陽性。結論克隆的Em-SP基因在原核中成功表達,表達產物具有良好的反應原性,可作為診斷試劑的候選抗原。

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【文章目錄】：
材料與方法
    1 材料
        1.1 蟲體
        1.2 主要試劑
    2 方法
        2.1 Em-SP基因的擴增
        2.2 Em-SP基因編碼氨基酸同源序列分析及進化樹構建
        2.3 pET30a-Em-SP重組質粒的構建
        2.4 重組蛋白的表達
        2.5 重組蛋白Em-SP的純化
        2.6 重組蛋白Em-SP的Western blot鑒定
        2.7 重組蛋白Em-SP反應原性鑒定
結 果
    1 Em-SP基因PCR擴增
    2 Em-SP基因編碼氨基酸同源性分析
    3 pET30a-Em-SP重組質粒的酶切鑒定
    4 重組蛋白Em-SP的表達
    5 重組蛋白Em-SP的Western blot鑒定結果
討 論



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