本文關(guān)鍵詞：梅花丁子香酚合酶基因的克隆及功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：花香是植物重要的觀賞性狀,在吸引昆蟲授粉、保障植物結(jié)實(shí)和防御病蟲侵害等方面具有重要的作用,同時(shí)有利于提高植物本身的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。梅花(Prunus mume Sieb. et Zucc.)是我國的傳統(tǒng)名花,具有典型的香氣。丁子香酚是梅花重要的特征香氣成分之一,屬于苯丙烷類化合物,其生物合成是以乙酸松柏酯為底物、通過丁子香酚合酶的催化作用完成的。目前,關(guān)于梅花花香的研究仍處于起步階段,尚未深入到合成代謝的分子機(jī)制水平。本論文以真梅系梅花品種‘三輪玉蝶’為試驗(yàn)材料,首次在梅花中克隆得到丁子香酚合酶基因,通過對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析、表達(dá)模式探究及轉(zhuǎn)基因初步驗(yàn)證,得出以下結(jié)論：1.以‘三輪玉蝶’的盛花期花朵為試驗(yàn)材料,通過RT-PCR技術(shù)克隆得到3個(gè)丁子香酚合酶基因,分別命名為PmEGS1/PmEGS2/PmEGS3,包含的開放閱讀框?yàn)?27bp/951 bp/930bp,編碼308/316/309個(gè)氨基酸,分子量約為33.9 kDa/35.3 kDa/ 33.8 kDa,位于梅花的第2/3/6條染色體上,基因序列號(hào)分別為Pm005841/Pm012360/ Pm021776。DNAMAN和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示,3個(gè)基因的cDNA全長及其推導(dǎo)的氨基酸序列均與草莓、月季、羅勒、仙女扇、矮牽牛、萬代蘭等物種中的EGS基因具有很高的一致性和同源性,在EGS基因所特有的結(jié)構(gòu)域KQVDVVIS和KIIAAIK上高度保守。2.以‘三輪玉蝶’的4個(gè)開花時(shí)期(蕾期、初花期、盛花期、末花期)和盛花期花朵3個(gè)不同部位(花瓣、雄蕊、花萼+雌蕊)為試驗(yàn)材料,進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。相對(duì)定量結(jié)果顯示,PmEGS2和PmEGS3主要分布在花瓣和雄蕊中,相對(duì)表達(dá)量隨開花進(jìn)程一直增加,至末花期達(dá)到最大值,與丁子香酚頂空揮發(fā)及內(nèi)源含量的變化規(guī)律一致,推測二者均為丁子香酚代謝途徑中生成丁子香酚的關(guān)鍵基因；且PmEGS2的變化幅度更大,表明具有更高的結(jié)合效率。PmEGS1表達(dá)趨勢相反,可能被其他競爭代謝途徑所抑制。3.將表達(dá)最顯著的PmEGS2與植物表達(dá)載體pCAMBIA1304相連接,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入矮牽牛(Petunia hybrida 'W115')。利用GC/MS檢測對(duì)照植株和轉(zhuǎn)基因植株的花香成分,發(fā)現(xiàn)對(duì)照植株中不含丁子香酚,而轉(zhuǎn)基因植株中含有少量的丁子香酚和微量的甲基丁子香酚,初步證明PmEGS2基因在丁子香酚通路發(fā)揮了作用,參與了丁子香酚的生物合成和代謝過程。本論文從具有典型香氣的梅花品種‘三輪玉蝶’中克隆得到3個(gè)丁子香酚合酶基因,對(duì)其表達(dá)情況進(jìn)行了初步分析,并將表達(dá)最顯著的PmEGS2轉(zhuǎn)入花香模式植物矮牽牛中,對(duì)基因功能進(jìn)行綜合研究,以期初步厘清其功能和分子機(jī)制,為李屬植物香花育種提供理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：梅花 丁子香酚合酶 基因克隆 表達(dá)分析 轉(zhuǎn)基因
【學(xué)位授予單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S685.17
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 1 引言10-22
• 1.1 植物花香化合物的種類10-11
• 1.2 苯丙烷/苯環(huán)型化合物的代謝途徑11-13
• 1.3 植物花香代謝調(diào)控與基因工程13-16
• 1.3.1 植物花香化合物的代謝調(diào)控13-14
• 1.3.2 植物花香基因的分離14-15
• 1.3.3 植物花香基因工程的育種策略及問題15-16
• 1.3.4 植物花香基因工程展望16
• 1.4 植物丁子香酚合酶研究進(jìn)展16-18
• 1.4.1 丁子香酚16-17
• 1.4.2 丁子香酚合酶基因17-18
• 1.5 梅花花香研究進(jìn)展18-19
• 1.6 本研究的設(shè)計(jì)思想19-22
• 1.6.1 研究的目的和意義19
• 1.6.2 研究內(nèi)容19
• 1.6.3 技術(shù)路線19-22
• 2 PmEGSs基因的克隆與序列分析22-38
• 2.1 材料22-23
• 2.1.1 植物材料22
• 2.1.2 主要試劑與耗材22
• 2.1.3 主要儀器與設(shè)備22
• 2.1.4 試驗(yàn)引物22-23
• 2.2 方法23-27
• 2.2.1 總RNA的提取與檢測23-24
• 2.2.2 cDNA第一鏈的合成24-25
• 2.2.3 RT-PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測25
• 2.2.4 PCR產(chǎn)物的純化、連接、轉(zhuǎn)化與鑒定25-27
• 2.2.5 PmEGSs基因生物信息學(xué)分析27
• 2.3 結(jié)果與分析27-35
• 2.3.1 PmEGSs基因的克隆27-28
• 2.3.2 PmEGSs基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)分析28-34
• 2.3.3 PmEGSs基因編碼蛋白的多重序列比對(duì)及進(jìn)化樹分析34-35
• 2.4 結(jié)論與討論35-38
• 3 PmEGSs基因的表達(dá)模式探究38-46
• 3.1 材料38-39
• 3.1.1 植物材料38
• 3.1.2 主要試劑與耗材38
• 3.1.3 主要儀器與設(shè)備38
• 3.1.4 試驗(yàn)引物38-39
• 3.2 方法39-40
• 3.2.1 RNA的提取及cDNA第一鏈的合成39-40
• 3.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR40
• 3.3 結(jié)果與分析40-42
• 3.3.1 PmEGSs基因在不同開花時(shí)期的表達(dá)分析40-41
• 3.3.2 PmEGSs基因在盛花期花朵不同部位的表達(dá)分析41-42
• 3.4 結(jié)論與討論42-46
• 4 轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證46-58
• 4.1 材料46
• 4.1.1 植物材料46
• 4.1.2 菌株與載體46
• 4.1.3 主要試劑與耗材46
• 4.1.4 主要儀器與設(shè)備46
• 4.2 方法46-51
• 4.2.1 載體的構(gòu)建及檢測46-48
• 4.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化矮牽牛48-50
• 4.2.3 轉(zhuǎn)基因矮牽牛的檢測50-51
• 4.3 結(jié)果與分析51-54
• 4.3.1 植物表達(dá)載體pCAMBIA1304-PmEGS2的構(gòu)建及農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化51-52
• 4.3.2 轉(zhuǎn)基因矮牽牛的篩選與檢測52-54
• 4.4 結(jié)論與討論54-58
• 5 結(jié)論58-60
• 5.1 結(jié)論58-59
• 5.2 展望59-60
• 參考文獻(xiàn)60-64
• 個(gè)人簡介64-66
• 導(dǎo)師簡介66-68
• 致謝68

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 王春梅;;丁子香酚和接種番茄黃化曲葉病毒對(duì)番茄幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶活性的影響[J];江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2013年09期

2 楊泓威;易圖永;雷穎;戴良英;;丁子香酚對(duì)黃瓜疫霉菌的室內(nèi)毒力測定[J];湖南農(nóng)業(yè)科學(xué);2012年05期

3 吉沐祥;吳祥;束兆林;費(fèi)志華;陳源;繆康;;新型植物源殺菌劑20%乙蒜·丁子香酚WP防治草莓灰霉病試驗(yàn)[J];農(nóng)藥;2010年06期

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2 肖曲;丁子香酚在番茄-土壤系統(tǒng)中的殘留降解動(dòng)態(tài)研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

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本文編號(hào)：402476