在發(fā)酵納豆類食物的過程中,納豆發(fā)酵菌能夠生產(chǎn)出一種堿性絲氨酸蛋白酶,即納豆激酶(Nattokinase,NK)。納豆激酶能夠有效的溶解纖維蛋白(人體內(nèi)血栓的主要成分),其作為一種新型溶栓類藥物或者保健食品,與同類尿激酶等產(chǎn)品相比具有著生產(chǎn)原料價(jià)格低廉、安全性高等優(yōu)勢,具有廣闊的市場前景。在納豆激酶工業(yè)生產(chǎn)過程中,由于蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)的破壞會出現(xiàn)熱損耗高、酶活性低等現(xiàn)象。通過分子生物學(xué)手段,對納豆激酶進(jìn)行改造以提高其熱穩(wěn)定性和酶活性,以獲得適應(yīng)納豆激酶大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的基因工程菌。本實(shí)驗(yàn)選擇使用pET-26b原核表達(dá)載體,分別構(gòu)建了含有納豆激酶成熟肽、前導(dǎo)肽+成熟肽的原核表達(dá)載體,并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中。在經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,離心收集菌體,超聲破碎菌體,SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)。纖維蛋白板法檢測表達(dá)蛋白的酶活。結(jié)果顯示,納豆激酶成熟肽及前導(dǎo)肽+成熟肽在大腸桿菌中均可成功表達(dá);成熟肽表達(dá)的上清液和沉淀,均未表現(xiàn)出纖溶活性;前導(dǎo)肽+成熟肽表達(dá)的上清液表現(xiàn)出纖溶活性,而沉淀未表現(xiàn)出纖溶活性。通過文獻(xiàn)閱讀和生物信息學(xué)預(yù)測,篩選出166位甘氨酸,xxx(具體位點(diǎn)涉及保密內(nèi)容,暫不公布...

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【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖0-1納豆激酶溶栓機(jī)制

圖0-1納豆激酶溶栓機(jī)制絲氨酸蛋白酶類對血栓有著出眾的溶解能力，能夠靈敏的感知并結(jié)合到交狀態(tài)下的纖維蛋白原[13]。納豆激酶作為該蛋白家族中的一員，是在已知的近0種溶栓物中最具潛力的溶解纖維蛋白酶[14]。近年來，研究人員對納豆激酶的

圖1-1NKm片段PCR結(jié)果

一章納豆激酶的原核表達(dá)）中加入150BP單位的牛P/ml；凝血酶溶液加入到1%的速混勻后倒入直徑為9cmμl樣品，37℃放置18h后的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖1-2NKm片段PCR結(jié)果

圖1-2NKm片段PCR結(jié)果L2000；0：陰性對照；1、NKm片段，大小分

圖1-3pET-26b-NKt菌落PCR結(jié)果

圖1-3pET-26b-NKt菌落PCR結(jié)果：DNAMarkerDL2000；0：陰性對照；1-9：菌落PCR產(chǎn)物

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