結(jié)直腸癌KRAS基因位于人體12號(hào)染色體的2號(hào)外顯子(Exon)上,在膜受體到腺苷酸環(huán)化酶的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的作用。近年來(lái),KRAS基因與抗EGFR抗體療效具有相關(guān)性是結(jié)直腸癌的研究領(lǐng)域中最突出的成果。研究結(jié)果顯示,只有KRAS未突變的患者,才推薦使用抗表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)單克隆抗體進(jìn)行治療。因此,靶向用藥前的基因突變檢測(cè)顯得尤為重要。本研究擬建立一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便且靈敏度高的結(jié)直腸癌KRAS基因檢測(cè)技術(shù)。通過(guò)基因克隆成功構(gòu)建出7種常見(jiàn)的KRAS基因突變序列,并設(shè)計(jì)7種等位基因引物和共用Taqman探針。單對(duì)引物檢測(cè)構(gòu)建成功的突變模板及等位基因引物和Taqman探針的特異性。7對(duì)引物混合后加入Taqman探針,利用qPCR分別檢測(cè)構(gòu)建成功的7種常見(jiàn)KRAS基因突變序列,搭建穩(wěn)定的檢測(cè)體系。對(duì)構(gòu)建的混合等位基因引物和Taqman探針qPCR檢測(cè)體系進(jìn)行分析性能測(cè)試:(1)結(jié)直腸癌KRAS野生型組織DNA為背景,將7種KRAS突變序列制備成相當(dāng)于10%、1%、0.1%和0.01%突變濃度的樣品。結(jié)果顯示,最低檢測(cè)限為0.1%。(2)結(jié)直腸癌KRAS野生型組織DNA為背景,分別檢測(cè)含有5...

【文章頁(yè)數(shù)】：95 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖1.1KRAS基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)

已知有三種類型的RAS基因(HRAS、KRAS和NRAS)與人類腫瘤相關(guān)。位于12號(hào)染色體上的KRAS基因，其所編碼的RAS蛋白，作為表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)發(fā)揮信號(hào)傳遞功能的組成部分，在....

圖1.2KRAS基因突變狀態(tài)調(diào)控機(jī)制

圖1.2KRAS基因突變狀態(tài)調(diào)控機(jī)制近些年來(lái)，KRAS基因狀態(tài)與抗EGFR抗體藥物治療之間具有顯著的相關(guān)性的研究結(jié)果是結(jié)直腸癌治療領(lǐng)域中的一項(xiàng)重大的發(fā)現(xiàn)。對(duì)于研究KRAS的基因狀態(tài)與抗EGFR藥物兩者之間關(guān)系的過(guò)程中，早在十年前的美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)(Americ....

圖2.1構(gòu)建KRAS基因突變序列示意圖

16圖2.1構(gòu)建KRAS基因突變序列示意圖2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1實(shí)驗(yàn)菌株與培養(yǎng)基感受態(tài)Top10細(xì)胞及pUC57載體購(gòu)于賽默飛世爾(中國(guó))有限公司LB液體培養(yǎng)基(1L)：蛋白胨10g、酵母浸粉5g、NaCl10g。LB固體培養(yǎng)基(1L)：蛋....

圖2.2KRAS基因突變序列1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證結(jié)果

菌的ddH2O于吸附柱的膜中間部位，為了使吸附柱中的核酸被完全洗脫下來(lái)需試驗(yàn)臺(tái)內(nèi)靜止5min，1.2×104rpm離心2min收集含有構(gòu)建好的KRAS突變序列的質(zhì)粒溶液。(11)吸附柱中可能會(huì)殘留質(zhì)粒，通過(guò)將步驟(10)中收集的質(zhì)粒溶液重新加入吸附柱中，1.....

本文編號(hào)：4012413