結直腸癌KRAS基因位于人體12號染色體的2號外顯子(Exon)上,在膜受體到腺苷酸環(huán)化酶的信號轉導中起著重要的作用。近年來,KRAS基因與抗EGFR抗體療效具有相關性是結直腸癌的研究領域中最突出的成果。研究結果顯示,只有KRAS未突變的患者,才推薦使用抗表皮生長因子受體(EGFR)單克隆抗體進行治療。因此,靶向用藥前的基因突變檢測顯得尤為重要。本研究擬建立一種經濟、簡便且靈敏度高的結直腸癌KRAS基因檢測技術。通過基因克隆成功構建出7種常見的KRAS基因突變序列,并設計7種等位基因引物和共用Taqman探針。單對引物檢測構建成功的突變模板及等位基因引物和Taqman探針的特異性。7對引物混合后加入Taqman探針,利用qPCR分別檢測構建成功的7種常見KRAS基因突變序列,搭建穩(wěn)定的檢測體系。對構建的混合等位基因引物和Taqman探針qPCR檢測體系進行分析性能測試:(1)結直腸癌KRAS野生型組織DNA為背景,將7種KRAS突變序列制備成相當于10%、1%、0.1%和0.01%突變濃度的樣品。結果顯示,最低檢測限為0.1%。(2)結直腸癌KRAS野生型組織DNA為背景,分別檢測含有5...

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1.1KRAS基因編碼蛋白結構

已知有三種類型的RAS基因(HRAS、KRAS和NRAS)與人類腫瘤相關。位于12號染色體上的KRAS基因，其所編碼的RAS蛋白，作為表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)發(fā)揮信號傳遞功能的組成部分，在....

圖1.2KRAS基因突變狀態(tài)調控機制

圖1.2KRAS基因突變狀態(tài)調控機制近些年來，KRAS基因狀態(tài)與抗EGFR抗體藥物治療之間具有顯著的相關性的研究結果是結直腸癌治療領域中的一項重大的發(fā)現。對于研究KRAS的基因狀態(tài)與抗EGFR藥物兩者之間關系的過程中，早在十年前的美國臨床腫瘤學會(Americ....

圖2.1構建KRAS基因突變序列示意圖

16圖2.1構建KRAS基因突變序列示意圖2.1實驗材料2.1.1實驗菌株與培養(yǎng)基感受態(tài)Top10細胞及pUC57載體購于賽默飛世爾(中國)有限公司LB液體培養(yǎng)基(1L)：蛋白胨10g、酵母浸粉5g、NaCl10g。LB固體培養(yǎng)基(1L)：蛋....

圖2.2KRAS基因突變序列1%瓊脂糖凝膠電泳驗證結果

菌的ddH2O于吸附柱的膜中間部位，為了使吸附柱中的核酸被完全洗脫下來需試驗臺內靜止5min，1.2×104rpm離心2min收集含有構建好的KRAS突變序列的質粒溶液。(11)吸附柱中可能會殘留質粒，通過將步驟(10)中收集的質粒溶液重新加入吸附柱中，1.....

本文編號：4012413