[目的]探究Lp PEX5蛋白表達(dá)與純化的最佳條件。[方法]從細(xì)葉百合的鱗莖中克隆出過氧化物酶體生物合成蛋白基因(Lp PEX5),在詳細(xì)分析該蛋白質(zhì)同源氨基酸序列比對、進(jìn)化樹、保守區(qū)域,二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測等生物信息學(xué)后,構(gòu)建到p QE-30原核表達(dá)載體上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15,通過SDS-PAGE凝膠電泳對不同誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度影響蛋白的表達(dá)量進(jìn)行研究。利用親核層析樹脂純化獲得融合蛋白。[結(jié)果]成功克隆出Lp PEX5基因,構(gòu)建p QE-Lp PEX5原核表達(dá)載體并且誘導(dǎo)和純化出Lp PEX5蛋白。[結(jié)論]Lp PEX5蛋白的最佳誘導(dǎo)條件為30℃,1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)5h。該研究為分析Lp PEX5蛋白的活性、驗(yàn)證蛋白間的相互作用等后續(xù)試驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。

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【部分圖文】：

圖1LpPEX5-TPCR檢測

菌落活化后，對誘導(dǎo)時(shí)間:0h、0.5h、1h、2h、3h、4h、5h;誘導(dǎo)溫度:20℃、25℃、30℃、37℃;IPTG濃度:0mmol/L、0.1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、1.5mmol/L等進(jìn)行探索，以尋找重組蛋白的最佳誘導(dǎo)條件....

圖2LpPEX5與其他同源蛋白的序列比較

包涵體蛋白的提取及重組蛋白的純化參照文獻(xiàn)[19]的方法，采用8mol/L尿素溶解包涵體，進(jìn)行蛋白的變性和復(fù)性。向純化柱中加入2mLGST純化樹脂，用無菌水清洗1次，再用PBS平衡。將復(fù)性后的蛋白上清液加入純化柱，輕柔顛倒混勻，靜置30min，過濾雜蛋白保存。用5mL....

圖3LpPEX5保守結(jié)構(gòu)域分析

ProtParam分析LpPEX5蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，分子式為C3686H5635N1035O1167S23，相對分子質(zhì)量為83857.90Da，總平均親水性為-0.531。圖4進(jìn)化樹分析LpPEX5蛋白的親緣關(guān)系

圖4進(jìn)化樹分析LpPEX5蛋白的親緣關(guān)系

圖3LpPEX5保守結(jié)構(gòu)域分析PSIPREDV4.0軟件預(yù)測LpPEX5蛋白是由許多螺旋和卷曲結(jié)構(gòu)構(gòu)成的二級結(jié)構(gòu)(圖5A);SWISS-MODEL軟件分析三級結(jié)構(gòu)(圖5B)。SMART軟件得出LpPEX5含有3個(gè)TPR結(jié)構(gòu)域(圖5C)。

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