為揭示水稻果糖激酶(OsFRK)家族基因的生物學(xué)功能,采用CRISPR/Cas9技術(shù),成功創(chuàng)建了2個已鑒定了的水稻OsFRK家族基因的敲除突變體;獲得28株OsFRK1的T₀代轉(zhuǎn)基因植株,其轉(zhuǎn)基因陽性率、突變率與純合突變率分別為100%、46.43%和10.71%;獲得14株OsFRK2的T₀代轉(zhuǎn)基因植株,其轉(zhuǎn)基因陽性率、突變率與純合突變率分別為92.86%、92.86%和21.43%;T₀代敲除純合突變體中目的蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域均發(fā)生不同程度的破壞。

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【部分圖文】：

圖1OsFRK1和OsFRK2的CRISPR/Cas9敲除靶點序列與位置

在Phytozome數(shù)據(jù)庫中下載OsFRK1和OsFRK2的基因序列，利用CRISPR–P和CRISPR–GE在線網(wǎng)站設(shè)計最佳的靶點(圖1)，在OsFRK1基因的第1個外顯子上設(shè)計了1個敲除靶點，由OsU6b啟動；在OsFRK2基因的第1個外顯子上設(shè)計了2個敲除靶點，分....

圖2水稻OsFRK1和OsFRK2的CRISPR敲除表達載體構(gòu)建

參考MA等[14]的方法，首先成功構(gòu)建了sgRNA表達盒，其2輪巢式PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果(圖2–A、圖2–B)顯示，第2輪PCR產(chǎn)物OsFRK1–OsU6b–gRNA、OsFRK2–OsU6a–gRNA、OsFRK2–OsU6b–gRNA電泳條帶大小與預(yù)期的基本....

圖3水稻OsFRK1和OsFRK2T0代轉(zhuǎn)基因植株的獲得過程

成功獲得CRISPR/Cas9敲除表達載體后，利用凍融法將其轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌(EHA105)感受態(tài)細胞中，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，獲得T0代轉(zhuǎn)基因水稻植株(圖3)。最終獲得28株OsFRK1基因的T0代轉(zhuǎn)基因植株和14株OsFRK2基因的T0代轉(zhuǎn)基因植株。這些轉(zhuǎn)基因植....

圖4T0代轉(zhuǎn)基因水稻植株的PCR檢測

在轉(zhuǎn)基因幼苗移栽至大田15d后，提取其葉片基因組DNA，對其轉(zhuǎn)基因植株的陽性率和敲除突變情況進行鑒定。對潮霉素抗性基因(HPT)進行PCR擴增條帶檢測(圖4)，其中HPT擴增片段大小為733bp；若無條帶，則表明無T–DNA插入。對T0代轉(zhuǎn)基因植株進行分析，結(jié)果(表2)顯示，2....

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