[目的]TIN2是一種端粒保護蛋白,在端粒蛋白復合體中起重要作用,目前已知的研究表明端粒保護蛋白復合體-Shelterin的結(jié)構(gòu)改變,可以引起端粒功能的紊亂,導致一系列疾病的發(fā)生。本實驗在建立穩(wěn)定的TIN2基因突變真核載體和空載體的人胃黏膜上皮細胞GES-1基礎(chǔ)上,來探討TIN2基因突變對人胃粘膜上皮GES-1細胞的端粒及染色體影響。[方法]建立穩(wěn)定的TIN2基因突變真核載體和空載體的人胃黏膜上皮細胞GES-1。通過免疫熒光/端粒肽核酸熒光原位雜交(PNA-Fish)實驗檢測TIN2基因突變是否能導致端粒DNA的損傷反應從而引發(fā)端粒功能障礙損傷灶(TIF),通過染色體實驗檢測TIN2基因突變能否導致染色體畸變(環(huán)狀染色體、染色體端-端融合)。Southern blot實驗檢測TIN2基因突變對端粒相對長度是否有影響。[結(jié)果]1、成功的構(gòu)建了穩(wěn)定的TIN2基因突變真核載體和空載體的人胃黏膜上皮細胞GES-1。2、PNA-Fish實驗發(fā)現(xiàn)空載體組和空白組未出現(xiàn)明顯損傷灶,TIN2基因突變真核載體的GES-1細胞組中出現(xiàn)了多于3個的端粒功能障礙損傷灶,其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05...

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖2.1突變載體圖譜

圖2.1突變載體圖譜（2）酶切TIN2基因1）雙酶切反應體系均為40μL40μL的pLV表達載體酶切反應體系如表1所示，反應的條件為37℃，3h。表1pLV表達載體的酶切反應體系containsvolumeApaLIApaLI＋NheI1.0μL1.....

圖3.2轉(zhuǎn)染后細胞熒光顯微鏡觀察結(jié)果（100倍）

注：第一行為模板序列（NCBI上down下來的TINF2原始CDS序列），第二行為構(gòu)建的TINF2突變載體上TINF2的測序結(jié)果，在690-700之間的C位點突變?yōu)門位點。3.2成功構(gòu)建TIN2基因突變真核載體和空載體的GES-1細胞3.2.1....

圖3.3Westernblot檢測各組細胞中TIN2基因突變蛋白的表達注：*P＜0.05，vsGES-1,GES-1-pLV

3.2.2TIN2基因突變真核載體和空載體的GES-1細胞中突變TIN2蛋白的表達由于TIN2基因突變蛋白沒有合適的特異性的抗體，為此我們在目的基因也就是TINF2的N端插入了一個FLAG標簽，標簽具有特定的抗原性，能被抗FLAG抗體識別。并且標簽很小，不會對目的基....

圖3.5染色體的形態(tài)（1000倍）

第3章結(jié)果注：*P＜0.05，vsGES-1,GES-1-pLV3.4染色體分析在1000倍油鏡下觀察細胞的染色體形態(tài)，記錄細胞染色體畸變的數(shù)目，每組各100個。如圖3.5所示，TIN2基因突變真核載體組出現(xiàn)了染色體畸變，空載體組和正常細胞組均未見明顯染色....

本文編號：3938953