[目的]TIN2是一種端粒保護(hù)蛋白,在端粒蛋白復(fù)合體中起重要作用,目前已知的研究表明端粒保護(hù)蛋白復(fù)合體-Shelterin的結(jié)構(gòu)改變,可以引起端粒功能的紊亂,導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)在建立穩(wěn)定的TIN2基因突變真核載體和空載體的人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1基礎(chǔ)上,來探討TIN2基因突變對(duì)人胃粘膜上皮GES-1細(xì)胞的端粒及染色體影響。[方法]建立穩(wěn)定的TIN2基因突變真核載體和空載體的人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1。通過免疫熒光/端粒肽核酸熒光原位雜交(PNA-Fish)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TIN2基因突變是否能導(dǎo)致端粒DNA的損傷反應(yīng)從而引發(fā)端粒功能障礙損傷灶(TIF),通過染色體實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TIN2基因突變能否導(dǎo)致染色體畸變(環(huán)狀染色體、染色體端-端融合)。Southern blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TIN2基因突變對(duì)端粒相對(duì)長(zhǎng)度是否有影響。[結(jié)果]1、成功的構(gòu)建了穩(wěn)定的TIN2基因突變真核載體和空載體的人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1。2、PNA-Fish實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)空載體組和空白組未出現(xiàn)明顯損傷灶,TIN2基因突變真核載體的GES-1細(xì)胞組中出現(xiàn)了多于3個(gè)的端粒功能障礙損傷灶,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05...

【文章頁(yè)數(shù)】：60 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖2.1突變載體圖譜

圖2.1突變載體圖譜（2）酶切TIN2基因1）雙酶切反應(yīng)體系均為40μL40μL的pLV表達(dá)載體酶切反應(yīng)體系如表1所示，反應(yīng)的條件為37℃，3h。表1pLV表達(dá)載體的酶切反應(yīng)體系containsvolumeApaLIApaLI＋NheI1.0μL1.....

圖3.2轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光顯微鏡觀察結(jié)果（100倍）

注：第一行為模板序列（NCBI上down下來的TINF2原始CDS序列），第二行為構(gòu)建的TINF2突變載體上TINF2的測(cè)序結(jié)果，在690-700之間的C位點(diǎn)突變?yōu)門位點(diǎn)。3.2成功構(gòu)建TIN2基因突變真核載體和空載體的GES-1細(xì)胞3.2.1....

圖3.3Westernblot檢測(cè)各組細(xì)胞中TIN2基因突變蛋白的表達(dá)注：*P＜0.05，vsGES-1,GES-1-pLV

3.2.2TIN2基因突變真核載體和空載體的GES-1細(xì)胞中突變TIN2蛋白的表達(dá)由于TIN2基因突變蛋白沒有合適的特異性的抗體，為此我們?cè)谀康幕蛞簿褪荰INF2的N端插入了一個(gè)FLAG標(biāo)簽，標(biāo)簽具有特定的抗原性，能被抗FLAG抗體識(shí)別。并且標(biāo)簽很小，不會(huì)對(duì)目的基....

圖3.5染色體的形態(tài)（1000倍）

第3章結(jié)果注：*P＜0.05，vsGES-1,GES-1-pLV3.4染色體分析在1000倍油鏡下觀察細(xì)胞的染色體形態(tài)，記錄細(xì)胞染色體畸變的數(shù)目，每組各100個(gè)。如圖3.5所示，TIN2基因突變真核載體組出現(xiàn)了染色體畸變，空載體組和正常細(xì)胞組均未見明顯染色....

本文編號(hào)：3938953