目的:惡性黑色素瘤是起源于人體組織中產(chǎn)生色素的黑素細(xì)胞的惡性腫瘤,這種疾病可以發(fā)生在許多不同部位,如皮膚、黏膜的表面、結(jié)膜以及葡萄膜等結(jié)構(gòu)。惡性黑色素瘤,特別是晚期惡性黑色素瘤是一種侵襲性極強(qiáng)、致死性極高的惡性腫瘤。隨著人們對(duì)黑色素瘤認(rèn)識(shí)的深入,分子靶向治療成為治療惡性黑色素瘤的有效手段之一。在獲得相對(duì)較好療效的同時(shí),耐藥性的出現(xiàn)使得人們必須尋找新的,更可靠的腫瘤相關(guān)基因和治療靶點(diǎn)。隨著分子生物學(xué),分子遺傳學(xué),基因功能組學(xué),蛋白質(zhì)組學(xué)以及二代測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展,如今發(fā)現(xiàn)并鑒定出新的腫瘤相關(guān)的致病基因變得更為可行和高效。本研究利用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾與芯片技術(shù),探討MAT2B基因在惡性黑色素瘤中的表達(dá)情況、如何影響惡性黑色素瘤細(xì)胞系的增殖和凋亡、裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)及其可能的下游效應(yīng)分子機(jī)制。方法:本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)GEO公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,特別是對(duì)于包含有惡性黑色素瘤細(xì)胞系或惡性黑色素瘤腫瘤組織與正常皮膚組織或痣中具有表達(dá)差異的基因進(jìn)行篩選。查閱相關(guān)文獻(xiàn)與已報(bào)道的基因功能并根據(jù)相關(guān)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選定候選的目的基因MAT2B,接著在5個(gè)惡性黑色素瘤細(xì)胞系、原發(fā)或轉(zhuǎn)移的惡性黑色素瘤...

【文章頁(yè)數(shù)】：121 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
英文縮略詞對(duì)照表
中文摘要
Abstract
1.前言
2.實(shí)驗(yàn)材料
    2.1 細(xì)胞株
    2.2 黑色素瘤病理標(biāo)本
    2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    2.4 主要試劑
    2.5 主要儀器與設(shè)備
    2.6 主要溶液和試劑的配制
3.實(shí)驗(yàn)方法
    3.1 Real-time PCR檢測(cè)MAT2B基因在5個(gè)惡性黑色素瘤細(xì)胞系中的表達(dá)情況
    3.2 免疫組化檢測(cè)MAT2B基因在原發(fā)或轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤以及痣標(biāo)本中的表達(dá)情況
        3.2.1 臨床資料及病理標(biāo)本的收集和石蠟切片的制作
        3.2.2 病理標(biāo)本的HE染色
        3.2.3 病理標(biāo)本的免疫組化染色
        3.2.4 免疫組化結(jié)果的判斷
    3.3 慢病毒介導(dǎo)的MAT2B基因的RNA干擾
        3.3.1 MAT2B基因RNA干擾序列以及陰性對(duì)照序列的確定
        3.3.2 合成雙鏈DNA oligo
        3.3.3 質(zhì)粒載體的酶切及線性化
        3.3.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定
        3.3.5 陽(yáng)性菌的培養(yǎng)與質(zhì)粒的抽提
        3.3.6 慢病毒的包裝、純化與滴度測(cè)定
        3.3.7 慢病毒感染人惡性黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375和Mel-RM .. 27
        3.3.8 Real-time PCR檢測(cè)慢病毒感染惡性黑色素瘤細(xì)胞系后，MAT2B基因m RNA水平變化
        3.3.9 Western Blot檢測(cè)慢病毒感染惡性黑色素瘤細(xì)胞系后，MAT2B蛋白水平變化
    3.4 Celigo全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀檢測(cè)MAT2B基因敲減后，A375細(xì)胞生長(zhǎng)情況的變化
    3.5 MTT檢測(cè)MAT2B基因敲減后黑色素瘤細(xì)胞的增殖情況
    3.6 MAT2B基因敲減后黑色素瘤細(xì)胞克隆形成能力檢測(cè)
    3.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)MAT2B基因敲減后惡性黑色素瘤細(xì)胞周期的變化
    3.8 MAT2B基因敲減后惡性黑色素瘤細(xì)胞凋亡的變化
    3.9 人惡性黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375裸鼠移植瘤模型的制作以及MAT2B基因敲減后裸鼠移植瘤生長(zhǎng)情況
    3.10 表達(dá)譜芯片檢測(cè)MAT2B敲減后差異表達(dá)的基因
    3.11 Real-time PCR和Western Blot對(duì)表達(dá)譜芯片檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證
    3.12 統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)方法
4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    4.1 Real-time PCR檢測(cè)MAT2B基因在5個(gè)人類惡性黑色素瘤細(xì)胞系中的表達(dá)情況
        4.1.1 PCR反應(yīng)的擴(kuò)增曲線
        4.1.2 PCR反應(yīng)的溶解曲線
        4.1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)
    4.2 免疫組化檢測(cè)MAT2B基因在原發(fā)或轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤以及痣標(biāo)本中的表達(dá)情況
        4.2.1 痣、原發(fā)或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤標(biāo)本的HE染色
        4.2.2 痣、原發(fā)或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤標(biāo)本的免疫組化染色
    4.3 慢病毒介導(dǎo)的MAT2B基因的RNA干擾
        4.3.1 MAT2B基因RNA干擾序列以及陰性對(duì)照序列的確定
        4.3.2 合成雙鏈DNA oligo
        4.3.3 質(zhì)粒載體的酶切及線性化
        4.3.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定
        4.3.5 純化后慢病毒滴度測(cè)定
        4.3.6 慢病毒感染人惡性黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375和Mel-RM
        4.3.7 Real-time PCR檢測(cè)慢病毒感染后MAT2B基因m RNA水平變化
        4.3.8 Western Blot檢測(cè)慢病毒感染后，MAT2B蛋白水平變化
    4.4 Celigo全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀檢測(cè)MAT2B基因敲減后細(xì)胞生長(zhǎng)情況的變化
    4.5 MTT檢測(cè)MAT2B基因敲減后惡性黑色素瘤細(xì)胞的增殖情況
    4.6 MAT2B基因敲減后惡性黑色素瘤細(xì)胞克隆形成能力檢測(cè)
    4.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)MAT2B基因敲減后惡性黑色素瘤細(xì)胞周期的變化
    4.8 MAT2B基因敲減后惡性黑色素瘤細(xì)胞凋亡的變化
    4.9 MAT2B基因敲減后裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)情況
    4.10 表達(dá)譜芯片檢測(cè)MAT2B敲減后差異表達(dá)的基因
        4.10.1 RNA樣品的質(zhì)檢結(jié)果
        4.10.2 表達(dá)譜芯片結(jié)果的IPA分析
    4.11 Real-time PCR和Western Blot對(duì)表達(dá)譜芯片檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證
5.討論
6.結(jié)論
7.參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
課題綜述
    參考文獻(xiàn)



本文編號(hào)：3927328