隨著人類對多個物種全基因組的相繼解析,基因的功能性研究愈發(fā)重要。從20世紀80年代末興起的基因打靶技術(shù)開始,越來越多的基因編輯技術(shù)被應(yīng)用于基因功能的研究。CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)作為一種新型基因操控技術(shù),可以精確、高效的對基因組進行敲除或者修飾,從而更好地完成基因功能研究。aroA基因編碼的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)是革蘭氏陰性菌和陽性菌芳香族氨基酸生物合成途徑中重要的酶,缺失該基因可對細菌的毒力產(chǎn)生明顯的減弱作用。本研究旨在利用CRISPR/Cas9新型基因編輯技術(shù)構(gòu)建大腸桿菌aroA基因的敲除系統(tǒng),并分析其對不同大腸桿菌aroA基因敲除、修復(fù)的差異,探討利用該敲除系統(tǒng)對其它相關(guān)細菌aroA基因進行敲除修復(fù)的可行性,為進一步研究致病菌aroA基因功能及開發(fā)減毒大腸桿菌疫苗提供新型、有效的基因敲除工具。通過比對分析不同大腸桿菌菌株aroA基因及其上下游序列,設(shè)計相應(yīng)引物并構(gòu)建靶向aroA基因的CRISPR/Cas9載體；鑒于原核生物大多缺乏非同源末端連接修復(fù)機制,可人工設(shè)計同源修復(fù)供體(Donor)基因序列,并亞克隆到CRISPR/Cas9載體中,構(gòu)建...

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
常用英文縮略詞表
第一章 綜述及研究目的與意義
    1 文獻綜述
        1.1 研究概況
        1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)展歷史
        1.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的組織結(jié)構(gòu)
        1.4 CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類
        1.5 CRISPR/Cas系統(tǒng)的免疫機理
        1.6 CRISPR/Cas系統(tǒng)的應(yīng)用歷程
        1.7 CRISPR/Cas9系統(tǒng)脫靶效應(yīng)
        1.8 aroA基因的研究進展
    2 本研究的目的和意義
第二章 利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建大腸桿菌aroA基因的敲除系統(tǒng)及其初步應(yīng)用
    1 材料
        1.1 菌株和質(zhì)粒
        1.2 主要試劑
        1.3 主要實驗儀器設(shè)備
    2 方法
        2.1 sgRNA的設(shè)計和相關(guān)引物的合成
        2.2 sgRNA載體的構(gòu)建
            2.2.1 sgRNA的退火連接
            2.2.2 psgRNA-GFP質(zhì)粒的酶切
            2.2.3 酶切質(zhì)粒的純化回收
            2.2.4 連接反應(yīng)
            2.2.5 感受態(tài)細胞的制備
            2.2.6 轉(zhuǎn)化
            2.2.7 陽性克隆菌的篩選
            2.2.8 重組質(zhì)粒的PCR鑒定、序列測定
        2.3 aroA基因同源臂(Donor)載體的構(gòu)建
            2.3.1 大腸桿菌DH10B基因組DNA的提取
            2.3.2 aroA基因同源臂的PCR擴增
            2.3.3 目的基因和質(zhì)粒的酶切
            2.3.4 目的基因的連接與轉(zhuǎn)化
            2.3.5 陽性克隆的篩選與鑒定
            2.3.6 完整aroA基因Donor載體的構(gòu)建與鑒定
        2.4 含sgRNA及aroA基因同源臂載體的構(gòu)建
        2.5 DH5α、DH10B、JM109菌株aroA基因的敲除及篩選
            2.5.1 分步轉(zhuǎn)化
            2.5.2 PCR及克隆鑒定
        2.6 基因缺失菌生長曲線的測定
    3 結(jié)果
        3.1 sgRNA的設(shè)計
        3.2 sgRNA載體構(gòu)建結(jié)果
        3.3 aroA基因同源臂載體的構(gòu)建結(jié)果
        3.4 psgRNA-GFP-aroAsgRNA-Donor載體構(gòu)建結(jié)果
        3.5 對不同大腸桿菌aroA基因敲除效率的檢測結(jié)果
        3.6 基因缺失菌生長曲線的測定結(jié)果
    4 討論
第三章 結(jié)論
參考文獻
附錄
致謝



本文編號：3877152