乳腺癌是女性最多發(fā)的一種癌癥,其死亡率逐年增加,而乳腺癌致死的主要原因是癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,目前對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移的研究已經(jīng)成為乳腺癌研究的熱點(diǎn)。上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)是近些年被大家接受的乳腺癌轉(zhuǎn)移模型。上皮型鈣粘蛋白(E-cadherin)是EMT的典型標(biāo)志物,在EMT過(guò)程中,E-cadherin表達(dá)下調(diào)或缺失,所以E-cadherin的下調(diào)被認(rèn)為是與乳腺癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移正相關(guān)。然而在臨床檢測(cè)中,該基因在許多乳腺癌轉(zhuǎn)移灶表現(xiàn)為高表達(dá),因而其在乳腺癌發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用需要進(jìn)一步深入的探討。本文利用高表達(dá)E-cadherin并且高轉(zhuǎn)移性小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1為模型,通過(guò)構(gòu)建E-cadherin基因(CDH1)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的雙熒光蛋白報(bào)告基因載體,采用流式細(xì)胞儀分選的方法分選出E-cadherin表達(dá)陽(yáng)性和陰性細(xì)胞,進(jìn)而對(duì)分選的細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)觀察細(xì)胞的形態(tài)特征與差異,也為進(jìn)一步研究?jī)煞N不同細(xì)胞亞群的生物學(xué)行為建立基礎(chǔ)。結(jié)果如下,激光共聚焦顯微鏡檢查結(jié)果表明CDH1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的雙熒光蛋白報(bào)告基因載體構(gòu)建成功,流式細(xì)胞儀分選后E-cadherin陽(yáng)性和陰性細(xì)胞體外培養(yǎng)表現(xiàn)出明顯差異,主要為CDH1陰性...

【文章頁(yè)數(shù)】：69 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 乳腺癌及其分型
    1.2 乳腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制
        1.2.1 發(fā)展模型
        1.2.2 臨時(shí)隔間模型
        1.2.3 融合模型
        1.2.4 基因轉(zhuǎn)移模型
        1.2.5 早期癌變模型
        1.2.6 上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化模型(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)
        1.2.7 循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)作為對(duì)EMT的補(bǔ)充
    1.3 EMT的三種類型及其相反的MET過(guò)程
        1.3.1 EMT的三種類型
        1.3.2 MET作為EMT的反過(guò)程
    1.4 EMT的標(biāo)記物
        1.4.1 細(xì)胞表面標(biāo)記物
        1.4.2 細(xì)胞骨架標(biāo)記物
        1.4.3 細(xì)胞外基質(zhì)標(biāo)記物
        1.4.4 EMT相關(guān)的調(diào)控因子
    1.5 E-cadherin與EMT調(diào)控
        1.5.1 E-cadherin
        1.5.2 E-cadherin參與調(diào)控EMT
        1.5.3 TGF-β參與EMT調(diào)控
    1.6 E-cadherin與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)系
        1.6.1 E-cadherin的缺失與癌細(xì)胞侵潤(rùn)的關(guān)系
        1.6.2 E-cadherin的表達(dá)與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)系
    1.7 雙熒光載體用于對(duì)E-cadherin的細(xì)胞標(biāo)記
第二章 雙熒光蛋白報(bào)告基因載體的構(gòu)建
    2.1 材料
        2.1.1 試驗(yàn)材料
        2.1.2 試劑
        2.1.3 儀器
        2.1.4 培養(yǎng)基
    2.2 方法
        2.2.1 Kozak-mcherry-ployA片段的克隆
        2.2.2 TATA-Kozak-mcherry-ployA片段的克隆
        2.2.3 CAAT-TATA-Kozak-mcherry-ployA片段的克隆
        2.2.4 pmCherry-pluspEGFP-N1載體的構(gòu)建
        2.2.5 pEF1片段的克隆
        2.2.6 pEF1-pmCherry- pluspEGFP-N1載體的構(gòu)建
        2.2.7 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染4T1細(xì)胞和共聚焦顯微鏡檢測(cè)熒光蛋白活性
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 pEF1-pmCherry- pluspEGFP-N1載體可以同時(shí)表達(dá)兩種熒光蛋白
第三章 小鼠CDH1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的雙熒光蛋白報(bào)告基因載體的構(gòu)建及活性檢測(cè)
    3.1 材料
        3.1.1 試驗(yàn)材料
        3.1.2 試驗(yàn)主要試劑
        3.1.3 試驗(yàn)儀器
        3.1.4 培養(yǎng)基
        3.1.5 試驗(yàn)耗材
        3.1.6 網(wǎng)絡(luò)資源及軟件
    3.2 方法
        3.2.1 CDH1啟動(dòng)子(500bp、1000bp)引物設(shè)計(jì)
        3.2.2 4T1細(xì)胞復(fù)蘇
        3.2.3 4T1細(xì)胞培養(yǎng)
        3.2.4 4T1細(xì)胞基因組DNA提取
        3.2.5 CDH1啟動(dòng)子(500、1000bp)擴(kuò)增
        3.2.6 構(gòu)建pMD19-T Simple/CDH1 Promoter(500bp、1000bp)克隆載體
        3.2.7 雙酶切pMD19-T Simple/CDH1 Promoter(500bp、1000bp)克隆載體和pEF1-pmCherry-pluspEGFP-N1(雙熒光載體)
        3.2.8 構(gòu)建pEF1-pmCherry- pluspEGFP-N1/CDH1 Prompter(500bp)、pEF1-pmCherry- pluspEGFP-N1/CDH1 Promoter(1000bp)重組質(zhì)粒
        3.2.9 pEF1-pmCherry- pluspEGFP-N1/CDH1 Promoter(500bp、1000bp)重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定
        3.2.10 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染4T1細(xì)胞和共聚焦顯微鏡檢測(cè)熒光蛋白活性
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 4T1細(xì)胞基因組DNA提取
        3.3.2 CDH1基因啟動(dòng)子(500bp、1000bp)擴(kuò)增
        3.3.3 pMD19-T Simple/CDH1 Promoter(500bp、1000bp)菌落PCR鑒定
        3.3.4 pMD19-T Simple/CDH1 Promoter(500bp、1000bp)載體和pEF1-pmCherry- pluspEGFP-N1雙酶切結(jié)果
        3.3.5 pEF1-pmCherry- pluspEGFP-N1/CDH1 Promoter(500bp、1000bp)重組質(zhì)粒菌落PCR及雙酶切鑒定結(jié)果
        3.3.6 pEF1-pmCherry- pluspEGFP-N1/CDH1 Promoter(500bp、1000bp)重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定
        3.3.7 熒光蛋白活性的共聚焦顯微鏡檢測(cè)
        3.3.8 啟動(dòng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析
第四章 CDH1陽(yáng)性細(xì)胞和CDH1陰性細(xì)胞流式分選及體外培養(yǎng)觀察
    4.1 材料
        4.1.1 試驗(yàn)材料
        4.1.2 試驗(yàn)主要試劑
        4.1.3 試驗(yàn)儀器
        4.1.4 培養(yǎng)基
    4.2 方法
        4.2.1 4T1細(xì)胞培養(yǎng)及pEF1-pmCherry- pluspEGFP-N1/CDH1 Promoter(1000bp)轉(zhuǎn)染
        4.2.2 分選前的細(xì)胞準(zhǔn)備
        4.2.3 流式分選
        4.2.4 分選后的細(xì)胞培養(yǎng)
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 E-cadherin陽(yáng)性細(xì)胞和E-cadherin陰性細(xì)胞的流式分選結(jié)果
        4.3.2 E-cadherin陽(yáng)性細(xì)胞和E-cadherin陰性細(xì)胞培養(yǎng)觀察
第五章 討論與結(jié)論
    5.1 討論
        5.1.1 E-cadherin的缺失是EMT及轉(zhuǎn)移的必要不充分條件
        5.1.2 轉(zhuǎn)移灶處有誘導(dǎo)E-cadherin表達(dá)的反式作用因子導(dǎo)致其在轉(zhuǎn)移灶高表達(dá)
        5.1.3 E-cadherin是多條癌細(xì)胞通路的下游調(diào)控靶基因
    5.2 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表文章



本文編號(hào)：3859466