乳腺癌是女性最多發(fā)的一種癌癥,其死亡率逐年增加,而乳腺癌致死的主要原因是癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,目前對乳腺癌轉(zhuǎn)移的研究已經(jīng)成為乳腺癌研究的熱點(diǎn)。上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)是近些年被大家接受的乳腺癌轉(zhuǎn)移模型。上皮型鈣粘蛋白(E-cadherin)是EMT的典型標(biāo)志物,在EMT過程中,E-cadherin表達(dá)下調(diào)或缺失,所以E-cadherin的下調(diào)被認(rèn)為是與乳腺癌浸潤和轉(zhuǎn)移正相關(guān)。然而在臨床檢測中,該基因在許多乳腺癌轉(zhuǎn)移灶表現(xiàn)為高表達(dá),因而其在乳腺癌發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用需要進(jìn)一步深入的探討。本文利用高表達(dá)E-cadherin并且高轉(zhuǎn)移性小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1為模型,通過構(gòu)建E-cadherin基因(CDH1)啟動子驅(qū)動的雙熒光蛋白報(bào)告基因載體,采用流式細(xì)胞儀分選的方法分選出E-cadherin表達(dá)陽性和陰性細(xì)胞,進(jìn)而對分選的細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)觀察細(xì)胞的形態(tài)特征與差異,也為進(jìn)一步研究兩種不同細(xì)胞亞群的生物學(xué)行為建立基礎(chǔ)。結(jié)果如下,激光共聚焦顯微鏡檢查結(jié)果表明CDH1啟動子驅(qū)動的雙熒光蛋白報(bào)告基因載體構(gòu)建成功,流式細(xì)胞儀分選后E-cadherin陽性和陰性細(xì)胞體外培養(yǎng)表現(xiàn)出明顯差異,主要為CDH1陰性...

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 乳腺癌及其分型
    1.2 乳腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制
        1.2.1 發(fā)展模型
        1.2.2 臨時隔間模型
        1.2.3 融合模型
        1.2.4 基因轉(zhuǎn)移模型
        1.2.5 早期癌變模型
        1.2.6 上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化模型(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)
        1.2.7 循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)作為對EMT的補(bǔ)充
    1.3 EMT的三種類型及其相反的MET過程
        1.3.1 EMT的三種類型
        1.3.2 MET作為EMT的反過程
    1.4 EMT的標(biāo)記物
        1.4.1 細(xì)胞表面標(biāo)記物
        1.4.2 細(xì)胞骨架標(biāo)記物
        1.4.3 細(xì)胞外基質(zhì)標(biāo)記物
        1.4.4 EMT相關(guān)的調(diào)控因子
    1.5 E-cadherin與EMT調(diào)控
        1.5.1 E-cadherin
        1.5.2 E-cadherin參與調(diào)控EMT
        1.5.3 TGF-β參與EMT調(diào)控
    1.6 E-cadherin與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)系
        1.6.1 E-cadherin的缺失與癌細(xì)胞侵潤的關(guān)系
        1.6.2 E-cadherin的表達(dá)與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)系
    1.7 雙熒光載體用于對E-cadherin的細(xì)胞標(biāo)記
第二章 雙熒光蛋白報(bào)告基因載體的構(gòu)建
    2.1 材料
        2.1.1 試驗(yàn)材料
        2.1.2 試劑
        2.1.3 儀器
        2.1.4 培養(yǎng)基
    2.2 方法
        2.2.1 Kozak-mcherry-ployA片段的克隆
        2.2.2 TATA-Kozak-mcherry-ployA片段的克隆
        2.2.3 CAAT-TATA-Kozak-mcherry-ployA片段的克隆
        2.2.4 pmCherry-pluspEGFP-N1載體的構(gòu)建
        2.2.5 pEF1片段的克隆
        2.2.6 pEF1-pmCherry- pluspEGFP-N1載體的構(gòu)建
        2.2.7 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染4T1細(xì)胞和共聚焦顯微鏡檢測熒光蛋白活性
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 pEF1-pmCherry- pluspEGFP-N1載體可以同時表達(dá)兩種熒光蛋白
第三章 小鼠CDH1啟動子驅(qū)動的雙熒光蛋白報(bào)告基因載體的構(gòu)建及活性檢測
    3.1 材料
        3.1.1 試驗(yàn)材料
        3.1.2 試驗(yàn)主要試劑
        3.1.3 試驗(yàn)儀器
        3.1.4 培養(yǎng)基
        3.1.5 試驗(yàn)耗材
        3.1.6 網(wǎng)絡(luò)資源及軟件
    3.2 方法
        3.2.1 CDH1啟動子(500bp、1000bp)引物設(shè)計(jì)
        3.2.2 4T1細(xì)胞復(fù)蘇
        3.2.3 4T1細(xì)胞培養(yǎng)
        3.2.4 4T1細(xì)胞基因組DNA提取
        3.2.5 CDH1啟動子(500、1000bp)擴(kuò)增
        3.2.6 構(gòu)建pMD19-T Simple/CDH1 Promoter(500bp、1000bp)克隆載體
        3.2.7 雙酶切pMD19-T Simple/CDH1 Promoter(500bp、1000bp)克隆載體和pEF1-pmCherry-pluspEGFP-N1(雙熒光載體)
        3.2.8 構(gòu)建pEF1-pmCherry- pluspEGFP-N1/CDH1 Prompter(500bp)、pEF1-pmCherry- pluspEGFP-N1/CDH1 Promoter(1000bp)重組質(zhì)粒
        3.2.9 pEF1-pmCherry- pluspEGFP-N1/CDH1 Promoter(500bp、1000bp)重組質(zhì)粒測序鑒定
        3.2.10 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染4T1細(xì)胞和共聚焦顯微鏡檢測熒光蛋白活性
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 4T1細(xì)胞基因組DNA提取
        3.3.2 CDH1基因啟動子(500bp、1000bp)擴(kuò)增
        3.3.3 pMD19-T Simple/CDH1 Promoter(500bp、1000bp)菌落PCR鑒定
        3.3.4 pMD19-T Simple/CDH1 Promoter(500bp、1000bp)載體和pEF1-pmCherry- pluspEGFP-N1雙酶切結(jié)果
        3.3.5 pEF1-pmCherry- pluspEGFP-N1/CDH1 Promoter(500bp、1000bp)重組質(zhì)粒菌落PCR及雙酶切鑒定結(jié)果
        3.3.6 pEF1-pmCherry- pluspEGFP-N1/CDH1 Promoter(500bp、1000bp)重組質(zhì)粒測序鑒定
        3.3.7 熒光蛋白活性的共聚焦顯微鏡檢測
        3.3.8 啟動子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析
第四章 CDH1陽性細(xì)胞和CDH1陰性細(xì)胞流式分選及體外培養(yǎng)觀察
    4.1 材料
        4.1.1 試驗(yàn)材料
        4.1.2 試驗(yàn)主要試劑
        4.1.3 試驗(yàn)儀器
        4.1.4 培養(yǎng)基
    4.2 方法
        4.2.1 4T1細(xì)胞培養(yǎng)及pEF1-pmCherry- pluspEGFP-N1/CDH1 Promoter(1000bp)轉(zhuǎn)染
        4.2.2 分選前的細(xì)胞準(zhǔn)備
        4.2.3 流式分選
        4.2.4 分選后的細(xì)胞培養(yǎng)
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 E-cadherin陽性細(xì)胞和E-cadherin陰性細(xì)胞的流式分選結(jié)果
        4.3.2 E-cadherin陽性細(xì)胞和E-cadherin陰性細(xì)胞培養(yǎng)觀察
第五章 討論與結(jié)論
    5.1 討論
        5.1.1 E-cadherin的缺失是EMT及轉(zhuǎn)移的必要不充分條件
        5.1.2 轉(zhuǎn)移灶處有誘導(dǎo)E-cadherin表達(dá)的反式作用因子導(dǎo)致其在轉(zhuǎn)移灶高表達(dá)
        5.1.3 E-cadherin是多條癌細(xì)胞通路的下游調(diào)控靶基因
    5.2 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表文章



本文編號：3859466