鱟素Ⅰ(TachyplesinsⅠ,TP-Ⅰ)是存在于東方鱟血細胞中的由17個氨基酸組成的小分子陽離子抗菌肽,結(jié)構(gòu)內(nèi)含2個二硫鍵,其二級結(jié)構(gòu)為2個逆向平行的β-折疊通過1個β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)連接。TP-Ⅰ具有強烈的抑殺細菌、真菌、病毒及腫瘤細胞等多種生物活性,被公認為是抗生素潛在替代藥物,在醫(yī)藥、畜牧、食品添加劑以及培育農(nóng)作物新品種等領(lǐng)域均有廣闊的應用前景,但由于其獲得途徑受限制,導致目前并沒有規(guī)�；疶P-Ⅰ商業(yè)產(chǎn)品出現(xiàn)。為解決此類問題,本課題以串聯(lián)TP-I基因為目的基因,利用基因工程技術(shù)構(gòu)建高效表達TP-I的畢赤酵母(Pastoris pichia)真核表達體系,并且對表達產(chǎn)物進行各方面分析。首先,根據(jù)文獻中已報道的TP-I肽氨基酸序列,分析TP-I多肽結(jié)構(gòu)與其抑殺菌活性的關(guān)系、畢赤酵母菌對TP-I多肽的耐受情況等,選擇具有17個氨基酸序列的TP-I肽作為目標序列。為實現(xiàn)選擇的TP-I抗菌肽在工程菌中的高效表達,設計利用胰肽酶E的特異酶切位點-Ala↓或-Gly↓和羧肽酶A特異性酶切位點(序列C末端氨基酸),連接選定的4肽構(gòu)成4拷貝串聯(lián)74肽,根據(jù)畢赤酵母菌重組表達偏愛密碼子原則,合成重組...

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 引言
    1 抗菌肽簡介
    2 鱟素的研究情況
        2.1 鱟素分子結(jié)構(gòu)和生物活性
        2.2 鱟素的作用機制
        2.3 鱟素的基因工程表達
        2.4 鱟素發(fā)展應用中存在的問題
        2.5 鱟素類肽的應用
    3 畢赤酵母菌的基因工程應用
        3.1 畢赤酵母真核表達系統(tǒng)簡介
        3.2 畢赤酵母菌表達系統(tǒng)的應用
    4 課題研究的來源、目的及意義
        4.1 課題來源
        4.2 研究目的和意義
第2章 TP-Ⅰ基因序列設計及其重組構(gòu)建
    1 實驗材料
        1.1 質(zhì)粒和菌株
        1.2 試劑
        1.3 儀器設備
        1.4 培養(yǎng)基和溶液配制
    2 實驗方法
        2.1 大腸桿菌TOP 10F’感受態(tài)細胞的制備
        2.2 pGAPZαB質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與篩選
        2.3 pGAPZαB質(zhì)粒的提取與鑒定
        2.4 限制性內(nèi)切酶酶切反應
        2.5 酶切片段的膠分離回收
        2.6 4TP-Ⅰ與pGAPZαB的酶連反應
        2.7 重組質(zhì)粒pGAPZαB-4TP-Ⅰ的轉(zhuǎn)化與篩選
    3 結(jié)果與分析
        3.1 重組串聯(lián)鱟素肽氨基酸序列設計
        3.2 重組串聯(lián)TP-Ⅰ表達載體pGAPZαB-4TP-Ⅰ的構(gòu)建
        3.3 目的基因測序結(jié)果
    4 小結(jié)
第3章 TP-Ⅰ畢赤酵母真核表達系統(tǒng)的構(gòu)建
    1 實驗材料
        1.1 質(zhì)粒和菌株
        1.2 試劑
        1.3 儀器設備
        1.4 培養(yǎng)基和溶液配制
    2 實驗方法
        2.1 工程菌GS115對化學合成TP-Ⅰ的耐受情況測定
        2.2 重組質(zhì)粒pGAPZαB-4TP-Ⅰ的大量提取
        2.3 重組質(zhì)粒pGAPZαB-4TP-Ⅰ的線性化與鑒定
        2.4 重組質(zhì)粒pGAPZαB-4TP-Ⅰ的純化與濃縮
        2.5 畢赤酵母菌GS115感受態(tài)細胞的制備
        2.6 畢赤酵母菌的電轉(zhuǎn)化
        2.7 組成型陽性菌株的篩選
        2.8 畢赤酵母菌基因組DNA的提取
        2.9 插入重組質(zhì)粒片段的PCR鑒定
        2.10 上清中表達產(chǎn)物的Tri-SDS-PAGE電泳
        2.11 高效表達鱟素菌株的篩選
    3 結(jié)果與分析
        3.1 工程菌GS115對化學合成TP-Ⅰ的耐受程度
        3.2 pGAPZαB-4TP-Ⅰ的線性化結(jié)果
        3.3 組成型陽性菌株的篩選結(jié)果
        3.4 插入重組質(zhì)粒片段的PCR與測序結(jié)果
        3.5 高效表達重組串聯(lián)鱟素肽菌株的篩選結(jié)果
    4 小結(jié)
第4章 重組TP-Ⅰ工程菌發(fā)酵產(chǎn)物分離純化及生物活性分析
    1 實驗材料
        1.1 質(zhì)粒和菌株
        1.2 試劑
        1.3 儀器設備
        1.4 培養(yǎng)基和溶液配制
    2 實驗方法
        2.1 工程菌GS115-GAPZαB-4TP-Ⅰ的生長曲線測定
        2.2 融合串聯(lián)多肽6His-4TP-Ⅰ的Ni-IDA親和層析柱純化
        2.3 串聯(lián)重組TP-Ⅰ的胰肽酶E酶解
        2.4 SephadexG-25填料去除胰肽酶E
        2.5 重組TP-Ⅰ單體的羧肽酶A酶解
        2.6 重組TP-Ⅰ單體含量測定
        2.7 重組TP-Ⅰ對各菌的抑菌實驗
    3 結(jié)果與分析
        3.1 工程菌GS115-GAPZαB-4TP-Ⅰ生長曲線測定結(jié)果
        3.2 親和層析純化融合多肽6His-4TP-Ⅰ的Tri-SDS-PAGE電泳結(jié)果
        3.3 串聯(lián)重組TP-Ⅰ的胰肽酶E酶解結(jié)果
        3.4 重組TP-Ⅰ單體含量測定結(jié)果
        3.5 重組TP-Ⅰ生物活性
    4 小結(jié)
第5章 研究結(jié)論與展望
    1 結(jié)論
    2 研究展望
致謝
參考文獻
附錄A：pGAPZαB-4TP-Ⅰ質(zhì)粒測序圖
附錄B：重組GS115基因組PCR產(chǎn)物測序圖
附錄C：重組TP-Ⅰ單體的質(zhì)譜分析結(jié)果
附錄D：重組TP-Ⅰ單體的RP-HPLC分析結(jié)果
攻讀學位期間的研究成果



本文編號：3836859